詳細介紹
運輸及保存:低溫運輸,,-20℃保存,有效期一年,。使用本試劑盒提供的陽性對照時,,由于其濃度較高,,一定要注意不要污染其他試劑和成分。在專門的區(qū)域操作,。本試劑盒不但準確,、快速、靈敏,,還具有以下
產(chǎn)品名稱 | 登革病毒型PCR試劑免費代測 |
英文名稱 | Dengue Virus(DENV)4RTPCR |
分類 | PCR檢測試劑盒 |
特點:
1. 即開即用,,用戶只需要提供樣品 DNA 模板,操作簡單,。
2. 預(yù)期的 PCR 產(chǎn)物長度為 494 bp,。
3. 本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷,。
反應(yīng)五要素:
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶、dNTP,、模板和Mg2+
引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,,只要知道任何一段模板DNA序列,, 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增,。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,,常用為20bp左右。
②引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,,特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,,否則會形成引物二聚體,,產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基,,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,,應(yīng)嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,, 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。
引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
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Q-PCR技術(shù):
實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)/QRT-PCR,,是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標記物,,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,后通過擴增曲線對未知模板進行定量分析的方法,。熒光定量PCR不僅實現(xiàn)真正實現(xiàn)了定量,,而且具有靈敏度和特異性、高能實現(xiàn)多重反應(yīng),、自動化程度高,、無污染、實時和準確等特點,。
熒光定量PCR所使用的熒光基團可分為兩種:熒光探針和熒光染料,。
1.使用SYBR熒光染料法來進行熒光定量PCR時,我們首先在PCR反應(yīng)體系中加入過量SYBR熒光染料,。SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后發(fā)射一定量的熒光信號,,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步,。
2.Taqman探針則是利用探針與模板的特異性結(jié)合的特點,,以及探針內(nèi)熒光報告基團和淬滅基團的分子特性來實現(xiàn)對PCR進行定量檢測。這種方法可以實現(xiàn)高靈敏度,,嚴格針對特定堿基序列的定量實驗,。