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ATCC菌種可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定,，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，省時(shí)少力。建議使用載體上的通用引物,。通常利用此方法進(jìn)行重組體的篩選或者DNA測序分析,。zui后的PCR產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。
具體方法：
1,、PCR混合物的制備
taq buffer（10×） 20 ul
dNTP（2.5 mM） 5 ul
primer Forward（50 mM） 10 ul
Primer Reverse（50 mM） 10 ul
ddH2O 147 ul
Taq（2U/ul） 8 ul
total 200 ul
將上述溶液混勻,，10 ul每管分裝于200 ul pcr管中。
2,、常溫下隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化板上的轉(zhuǎn)化子,，用滅菌的牙簽或槍頭挑取少量菌體，在LB瓊脂糖平板上輕點(diǎn),，做一拷貝,；然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應(yīng)的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數(shù)下（管子做好記號(hào)，如平板上點(diǎn)的是1＃,，則管子上也標(biāo)1＃,，以便篩選到克隆后的擴(kuò)到培養(yǎng)），蓋緊管子,。
3,、將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規(guī)條件擴(kuò)增,。電泳檢測是否得到目的片斷,。如有則為陽性克隆。
4,、將已經(jīng)接種有菌落的平板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,，使ATCC菌種擴(kuò)增；次日挑選陽性克隆做進(jìn)一步篩選或培養(yǎng),。步驟2也可以不點(diǎn)板,，直接接種搖菌，如果早上做PCR的話,，下午就可以提質(zhì)粒,，得到重組載體。
注意事項(xiàng)：設(shè)計(jì)引物很關(guān)鍵。一般如果是定向克隆,，用載體上的通用引物即可,；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克?。ㄈ鐔蚊盖谢蚱侥┒诉B接）,，一條引物用載體，一條引物用目的基因上的,，這樣就可以比較方便的鑒定了,，而且錯(cuò)誤概率很低。PCR條件的選擇接近,，同時(shí)挑取的ATCC菌種不宜太多,，否則會(huì)有非特異性擴(kuò)增。