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詳細介紹
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
魚源性成分(Fish)核酸檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心,，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增,。一般：在93℃預(yù)變性3-5min,，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次,，在72℃ 保7min。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進行抽提反應(yīng)混合液,，以除去石蠟油,；否則，直接取5-10μl電泳檢測,。
下列相關(guān)產(chǎn)品：
小鼠鐵蛋白(FE)PCR檢測試劑盒 ,，英文名： FE
小鼠白介素16(IL-16)ELISA檢測試劑盒MouseIerleukin16,IL-16ELISAKIT 50T
人骨形成蛋白6(BMP-6)免疫試劑盒 Human BMP-6
RatFattyacyl-CoAsyhetase,ACSELISAKit大鼠脂酰合成酶(ACS)PCR檢測試劑盒
721型分光光度儀1毫升1厘米光徑塑料比色皿1個
Mouseglucocoicoidreceptor,GRPCR檢測試劑盒小鼠糖皮質(zhì)類固醇受體(GR)PCR
實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,，并記錄在電腦軟件之中,，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此,，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期）,，此時微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定,，因此,，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法,。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性定量方法，已得到,，廣泛用于基因表達研究,、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領(lǐng)域,。
定量PCR方法：
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板,。在同一反應(yīng)管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,，分別測定熒光強度,，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b,、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,，下游引物不標(biāo)記,。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增,。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,，分別測定其熒光強度,，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
c,、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物,，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物,，最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo),，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實現(xiàn)定量檢測目的,。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
人脂蛋白相關(guān)0脂酶A2(Lp-PL-A2)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
Human tumor markers (CA724) ELISA Kit 人腫瘤標(biāo)志物(CA724)ELISA試劑盒
HumanCaspase3,Casp-3ELISAKit 人胱天3(Casp-3)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝
HumanImmuneRNA,IrnaELISA試劑盒人免疫核糖核酸(Irna)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
組織基質(zhì)金屬(MMP-1)活性比色法定量檢測試劑盒20次
HumanLeukoieneB4，LT-B4ELISAKit人白三烯B4(LTB4)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
小鼠抗Ⅲ抗體(AT-Ⅲ)ELISA試劑盒 ,，英文名： AT-Ⅲ ELISA Kit
大鼠核因子κB受體活化因子配基(RANKL)ELISA檢測試劑盒RaeceptoractivatorofnuclearfactorkappaBligand,RANKLELISAKit 96T/48T
人氧化代謝物 免疫試劑盒 Human Biopyrrin ELISA Kit
Ratplatelet-derivedgrowthfactor,PDGFELISAKit大鼠血小板衍生生長因子(PDGF)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
GST融合蛋白陽性表達點狀印跡篩選試劑盒10次
Mousethyroxine,T4ELISA試劑盒小鼠甲狀腺素(T4)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
魚源性成分(Fish)核酸檢測試劑盒Anti-Phospho-MAPKAPK2 (Thr222) /FITC 熒光素標(biāo)記0酸化原活化蛋白活化的蛋白2抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
Goat Anti-human IgG/Biotin 化羊抗人IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.1ml
睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子抗體 anti-CNTF 0.1ml
Mouse Anti-rabbit IgG/Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 488標(biāo)記的小鼠抗兔IgG 0.1ml
Phospho-FRA1 (Ser265) 英文名稱： 0酸化FRA-1蛋白抗體 0.1ml
Rhesus antibody Rh PIH1D1/NOP17 核仁同源蛋白17抗體 規(guī)格 0.2ml
Goat Anti-human IgG/Biotin 化羊抗人IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.1ml
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加,。
4.除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。產(chǎn)品僅用于科研實驗
7.每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值,。
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