化工儀器網(wǎng)
詳細介紹
實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中,，通過對每個樣品Ct值的計算,，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此,，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現(xiàn)性,，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系,，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法,。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的,、值得信賴的科學方法,。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,，重現(xiàn)性定量方法，已得到,，廣泛用于基因表達研究,、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領域,。
操作流程
收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
異尖線蟲(Ani)核酸檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
下列相關產(chǎn)品：
小鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGER)PCR檢測試劑盒 ,，英文名： AGER
兔鉤端IgG(Lebtospira)ELISA檢測試劑盒RabbitLebtospiraIgGELISAKit 50T
牛神經(jīng)肽Y(NPY)免疫試劑盒 Bovine neuropeptide Y,NPY
英文名稱HumahyroglobulinELISAKit人甲狀腺球蛋白(TG)
動物多酚氧化酶(polyphenoloxidase;PPO)活性比色法定量檢測試劑盒20次
RatPlateletFactor4,PF-4PCR
PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中,，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,，不加或添加石蠟油,。
2：調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min,，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min,。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結束反應,，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油,，需用100μl進行抽提反應混合液,，以除去石蠟油；否則,，直接取5-10μl電泳檢測,。
定量PCR方法：
a、競爭法 產(chǎn)品僅用于科研實驗
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板,。在同一反應管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度,，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,，內(nèi)標用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標記，下游引物不標記,。在模板擴增的同時,，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度,，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板,。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標記引物,，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結合,，再加入抗di高辛酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗,，若加入內(nèi)標，作出標準曲線,，也可實現(xiàn)定量檢測目的,。
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加,。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
小鼠乳酸脫氫酶(LDH)ELISA試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
Human visfatin / visfatin (visfatin) ELISA Kit 人內(nèi)脂素/內(nèi)臟脂肪素(visfatin)ELISA試劑盒
HumanSurfactaProteinD,SP-DELISAKit 人表面活性蛋白D(SP-D)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝
guineapighepatocytegrowthfactor,HGFELISA試劑盒豚鼠肝細胞生長因子(HGF)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
真菌/酵母細胞β-半乳糖苷酶活性比色法定量檢測試劑盒20次
MouseCeruloplasmin,CP/CERELISAKit小鼠銅藍蛋白(CP/CER)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
小鼠可溶性Toll樣受體9(sTLR9/sCD289)ELISA試劑盒 ,，英文名： sTLR9/sCD289 ELISA Kit
大鼠雙氫睪酮(DHT)ELISA檢測試劑盒RatDihydrotestosterone,DHTELISAKit 96T/48T
人3抗體(PR3Ab)免疫試劑盒 Human Proteinase 3 Aibody,PR3Ab ELISA Kit
Ratoxidizedlowdensitylipoprotein,OxLDLELISAKit大鼠氧化低密度脂蛋白(OxLDL)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
GILLS蘇木素復染試劑盒50次
Mousesolublemyosinheavychain2,sMHC-2ELISA試劑盒小鼠可溶性肌球蛋白重鏈2(sMHC-2)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
異尖線蟲(Ani)核酸檢測試劑盒Anti-SUR1/FITC 熒光素標記磺酰脲類藥物受體1抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
GSK-3 Beta, (Glycogen Synthase Kinase-3) 葡萄糖合成-3(抗原)Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
過氧化酶活化增生受體γ抗體 Anti-PPARγ 0.1ml
SPHK2 英文名稱： 鞘醇2抗體 0.2ml
Epsin2B 英文名稱： Epsin2B蛋白抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh Phospho-MSK1 (Ser212) 0酸化有絲分裂原和應激活化型蛋白1抗體 規(guī)格 0.1ml
GSK-3 Beta, (Glycogen Synthase Kinase-3) 葡萄糖合成-3(抗原)Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
化工儀器網(wǎng)