化工儀器網(wǎng)
詳細(xì)介紹
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存,。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
沙門氏菌SPP-sdfi核酸檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中,，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中,。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油,。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴增,。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次,，在72℃ 保7min。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,，以除去石蠟油,；否則，直接取5-10μl電泳檢測,。
下列相關(guān)產(chǎn)品：
小鼠胃泌素(GT)PCR檢測試劑盒 ,，英文名： GT
兔子補體片斷3a(C3a)ELISA檢測試劑盒RabbitComplemefragme3a,C3aELISAKit 50T
牛D(VD)免疫試劑盒 Bovine Vitamin D,VD
英文名稱HumanMacrophageInflammatoryProtein-1β，MIP-1βELISAkit人巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)
電鏡組織三固著液(2,4,6-imethylpyridinepuriss)50毫升
RatPepsin,PPP
實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期）,，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性,，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的,、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性定量方法,，已得到，廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究,，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域,。
定量PCR方法：
a,、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）,。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,，而待測模板不被酶切,，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度,，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記,。在模板擴增的同時,，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度,，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板,。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物,，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗,，若加入內(nèi)標(biāo),，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的,。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
大鼠γ-基受體亞基α1(GABRA1)ELISA試劑盒 ,，英文名： GABRA1 ELISA Kit
Mice, superoxide dismase (SOD) ELISA Kit 小鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒
ELISA 小鼠基質(zhì)金屬-2(mouse MMP-2) 48T/96T 進(jìn)口分裝
CLIAKitforIL-17ELISAKIT大鼠白介素17規(guī)格：48T/96T
通用型亮(leucine)含量比色法定量檢測試劑盒20次
ELISAKitADAMTS13/vWF-cp大鼠血管性血友病因子裂解規(guī)格：48T/96T
小鼠亮酸豐富重復(fù)LGI家族成員3(LGI3)ELISA試劑盒 ，英文名： LGI3 ELISA Kit
人腎小球組織糖基化終末產(chǎn)物(GTE-AGE)ELISA檢測試劑盒HumanGlomerulaissueexact-advancedglycosylationendproducts,GTE-AGEELISAKit 96T/48T
大鼠血小板衍生生長因子BB(PDGF-BB)免疫試劑盒 Rat platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB ELISA Kit
英文名稱RatHistoneDeacetylaseELISAKit大鼠組織蛋白去乙?；?span>(HD)規(guī)格：96T/48T
鈣離子膜通道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)利羅丁受體(ryanodinereceptor;RyR)功能熒光檢測試劑盒20次
ELISAKitITGαM/CD11b人整合素αM型規(guī)格：48T/96T
沙門氏菌SPP-sdfi核酸檢測試劑盒Anti-SHP2/PTPN11/FITC 熒光素標(biāo)記蛋白酪0酸酶2抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
ILK-1 (Integrin-linked protein kinase 1) 整合素連接-1Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
P物質(zhì)受體抗體 Anti-NK-1/SuRCtance P Receptor 0.1ml
Smad4 英文名稱： Smad4抗體 0.1ml
EVA1 英文名稱： 髓鞘蛋白P0樣蛋白2抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh Phospho-p63 (Ser395) 0酸化P63抑制基因抗體 規(guī)格 0.1ml
ILK-1 (Integrin-linked protein kinase 1) 整合素連接-1Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加,。
4.除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。產(chǎn)品僅用于科研實驗
7.每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。
化工儀器網(wǎng)