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詳細(xì)介紹
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存,。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
腦心肌炎病毒(EMCV)核酸檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中,。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心,，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min,，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min,。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油,，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,，以除去石蠟油；否則,，直接取5-10μl電泳檢測,。
下列相關(guān)產(chǎn)品：
小鼠纖維介素蛋白(FGL2)PCR檢測試劑盒 ，英文名： FGL2
兔子E選擇素(E-Selectin/CD62E)ELISA檢測試劑盒RabbitE-SelectinELISAkit 50T
牛乙酰羧化酶合成酶(ACC)免疫試劑盒 Bovine Acetyl-CoA Carboxylase Syhetase,ACC
英文名稱humanET-1ELISAKIT人內(nèi)皮素-1(ET-1)ELISAKIT
蛋白質(zhì)西方雜交10倍清理緩沖液500毫升
RatNeonatalThyroxine,NN-T4PCR檢
實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期）,，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性,，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增,，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的,、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性定量方法,，已得到，廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究,，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域,。
定量PCR方法：
a,、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板,。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）,。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切,，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。
b,、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標(biāo)記,，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時,，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板,。
c,、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物,，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗,，若加入內(nèi)標(biāo),，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實現(xiàn)定量檢測目的,。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
大鼠基轉(zhuǎn)移酶(ALT)ELISA試劑盒 ，英文名： ALT ELISA Kit
Mouse alpha glathione S ansferase (-GST) ELISA Kit 小鼠αS轉(zhuǎn)移酶(α-GST)ELISA試劑盒
ELISA 小鼠促卵泡素(mouse FSH) 48T/96T 進(jìn)口分裝
CLIAKitfom-1(MouseKidneyinjurymolecule1)ELISAKIT小鼠腎損傷分子1規(guī)格：48T/96T
通用型蛋白電泳考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒10次
ELISAKitTGF-α大鼠轉(zhuǎn)化生長因子α規(guī)格：48T/96T
小鼠免疫球蛋白G2(IgG2)ELISA試劑盒 ,，英文名： IgG2 ELISA Kit
大鼠甲狀腺素(T4)ELISA檢測試劑盒Ratthyroxine,T4ELISAKit 96T/48T
人酶(PON)免疫試劑盒 Human paraoxonase,PON ELISA Kit
RatMethemoglobin,MHBELISAKit大鼠高鐵血紅蛋白(MHB)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(DNMT-1)活性酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測試劑盒20次
Mousepituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptide,PACAPELISA試劑盒小鼠垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
腦心肌炎病毒(EMCV)核酸檢測試劑盒Anti-OTR/FITC 熒光素標(biāo)記受體抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
Mouse Anti-goat IgM/HRP 辣根過氧化物酶標(biāo)小鼠抗羊IgMMulti-class antibodies規(guī)格： 0.1ml
促進(jìn)凋亡基因抗體 Anti-CIDE-B 0.2ml
Mouse Anti-Rabbit IgM/Alexa Fluor 647 Alexa Fluor 647標(biāo)記的小鼠抗兔IgM 0.1ml
FIH1 英文名稱： 缺氧誘導(dǎo)因子1α抑制蛋白抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh PKA gamma 蛋白Aγ抗體 規(guī)格 0.2ml
Mouse Anti-goat IgM/HRP 辣根過氧化物酶標(biāo)小鼠抗羊IgMMulti-class antibodies規(guī)格： 0.1ml
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加,。
4.除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6.每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。產(chǎn)品僅用于科研實驗
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。
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