詳細介紹
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
豬圓環(huán)病毒通用型(PCV-U)核酸檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中,。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油,。
2:調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,,執(zhí)行擴增,。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,,循環(huán)30-35次,,在72℃ 保7min。
3:伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4:PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μl進行抽提反應(yīng)混合液,,以除去石蠟油,;否則,直接取5-10μl電泳檢測,。
下列相關(guān)產(chǎn)品:
小鼠心肌營養(yǎng)素1(CT-1)PCR檢測試劑盒 ,,英文名: CT-1
小鼠肝脂酶(HL)ELISA檢測試劑盒Mousehepaticlipase,HLELISAKit 50T
人花生四烯酸5脂氧合酶(ALOX5/LOG5)免疫試劑盒 Human Arachidonate 5-lipoxygenase,ALOX5/LOG5
RatC-PeptideELISAKit大鼠C肽(C-Peptide)PCR檢測試劑盒
20%Formalin固著液50毫升
MouseCXC-chemokineligand16,CX
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,,并記錄在電腦軟件之中,,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果,。因此,,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),,此時微小誤差尚未放大,,因此Ct值的重現(xiàn)性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,,得到的Ct值是恒定的,。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法,。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方法,。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,,重現(xiàn)性定量方法,已得到,,廣泛用于基因表達研究,、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領(lǐng)域,。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板,。在同一反應(yīng)管中,,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,,分別測定熒光強度,,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b,、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物,,內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,,下游引物不標記,。在模板擴增的同時,內(nèi)標也被擴增,。在PCR產(chǎn)物中,,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,,分別測定其熒光強度,,以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
c,、PCR-ELISA法
利用di高辛等標記引物,,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合,再加入抗di高辛酶標抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,,最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標,,作出標準曲線,,也可實現(xiàn)定量檢測目的。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品:
大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)ELISA試劑盒 ,,英文名: TGFβ1 ELISA Kit
Mouse ai cardiolipin aibody IgM (ACA-IgM) ELISA Kit 小鼠抗心0脂抗體IgM(ACA-IgM)ELISA試劑盒
MouseActivinAELISAKit 小鼠活化素A(Activin-A)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝
CLIAKitforHumankeratinocyteaocrinefactor/Amphiregulin,KAF/ARELISAKit人角化細胞內(nèi)分泌因子規(guī)格:48T/96T
微粒體S轉(zhuǎn)移酶(GSHST)活性酶動力比色法定量檢測試劑盒20次
大鼠抗IgE受體抗體ELISAKit大鼠抗IgE受體抗體ELISAKit,,48T/96T大鼠抗IgE受體抗體ELISAKit,48T/96T規(guī)格:48T/96T
小鼠/葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1(SGLT1)ELISA試劑盒 ,,英文名: SGLT1 ELISA Kit
人分泌型0脂酶A2(sPLA2)ELISA檢測試劑盒HumansecretedphospholipaseA2,sPLA2ELISAKit 96T/48T
大鼠胰α2A(AMY2A)免疫試劑盒 Rat Pancreatic alpha-amylase,AMY2A ELISA kit
英文名稱Humanapelin-12ELISAKit人apelin-12(apelin-12)規(guī)格:96T/48T
分子生物級溴化乙錠(EthidiumBromide)染色液(1毫克/毫升)或(10毫克/毫升)100毫升
ELISAKitCDK5人周期素依賴性5規(guī)格:48T/96T
豬圓環(huán)病毒通用型(PCV-U)核酸檢測試劑盒Anti-PRL1/PTP4A1/FITC 熒光素標記肝再生0酸酯酶1抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
Mouse Anti-rat IgG Whole serum 小鼠抗大鼠IgG抗血清Multi-class antibodies規(guī)格: 1ml
干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1抗體 Anti-IFITM1 0.2ml
Rabbit anti-Goat IgG whole serum 兔抗羊IgG抗血清 1ml
FGF18 英文名稱: 成纖維細胞生長因子18抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh phospho-RAD9(Ser328) 0酸化細胞周期檢查控制蛋白質(zhì)抗體 規(guī)格 0.1ml
Mouse Anti-rat IgG Whole serum 小鼠抗大鼠IgG抗血清Multi-class antibodies規(guī)格: 1ml
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標準品孔和樣本孔,,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,;
3.樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加,。
4.除空白孔外,,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體,吸水紙上拍干,,每孔加滿洗滌液(350μL),,靜置1min,甩去洗滌液,,吸水紙上拍干,,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機洗板)。
6.每孔加入底物A,、B各50μL,,37℃避光孵育15min。產(chǎn)品僅用于科研實驗
7.每孔加入終止液50μL,,15min內(nèi),,在450nm波長處測定各孔的OD值。