詳細(xì)介紹
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測(cè)序——>測(cè)序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實(shí)物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
人E-選擇素S128R基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒 | PCR檢測(cè)試劑盒 | 50T |
PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:
方法
1:在冰浴中,,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中,。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油,。
2:調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,,執(zhí)行擴(kuò)增,。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,,循環(huán)30-35次,,在72℃ 保7min,。
3:伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存,。
4:PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,,需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油,;否則,,直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
下列相關(guān)產(chǎn)品:
牡蠣包拉米蟲PCR檢測(cè)試劑盒 Bonamia ostreaePCR
包納米蟲屬通用PCR檢測(cè)試劑盒 Bonamia spp.PCR
羊邊界病病毒PCR檢測(cè)試劑盒 Border Disease Virus(BDV)RTPCR
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,,并記錄在電腦軟件之中,通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),,剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),,此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性,,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的,、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,,重現(xiàn)性定量方法,,已得到,廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究,,藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域,。
定量PCR方法:
a,、競(jìng)爭(zhēng)法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,,待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記),。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,,而待測(cè)模板不被酶切,,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,,分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù),。
b,、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標(biāo)記,,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),,內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,,分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板,。
c,、PCR-ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,,再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),,若加入內(nèi)標(biāo),,作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的,。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品:
大鼠細(xì)胞球蛋白(CYGB)ELISA試劑盒 ,,英文名: CYGB ELISA Kit
Mouse growth hormone releasing peptide (GHRP) ELISA Kit 小鼠生長激素釋放多肽(GHRP)ELISA試劑盒
Mouseplateletactivatingfactor,PAFELISAKIT 小鼠血小板活化因子(PAF)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
CLIAKitforHSP47ELISAKit大鼠熱休克蛋白47規(guī)格:48T/96T
細(xì)胞L-乳酸比色法定量檢測(cè)試劑盒20次
ELISAKitIL-1α大鼠白介素1α規(guī)格:48T/96T
小鼠熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒 ,英文名: Hsp-60 ELISA Kit
小鼠Ⅲ型膠原(ColⅢ)ELISA檢測(cè)試劑盒MouseCollageypeⅢ,ColⅢELISAKIT 96T/48T
人鈣網(wǎng)蛋白(C)免疫試劑盒 Human C ELISA Kit
RatIerferonβ,IFN-β/IFNBELISAKit大鼠β干擾素(IFN-β/IFNB)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
CASPASE-1蛋白表達(dá)ELISA定量檢測(cè)試劑盒25次
Mouselipoproteinlipase,LPLELISA試劑盒小鼠脂蛋白脂酶(LPL)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
人E-選擇素S128R基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒Anti-PRMT1/FITC 熒光素標(biāo)記蛋白質(zhì)精甲基轉(zhuǎn)移酶1抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
Rabbit Anti-human IgM Whole serum 兔抗人IgM抗血清Multi-class antibodies規(guī)格: 1ml
白介素13抗體 Anti-IL-13 0.1ml
Rabbit anti-MG IgG whole serum 兔抗長爪沙鼠IgG抗血清 1ml
FAHD1 英文名稱: FAHD1蛋白抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh phospho-PTPN6(Tyr476) 0酸化蛋白酪0酸酶1C抗體 規(guī)格 0.1ml
Rabbit Anti-human IgM Whole serum 兔抗人IgM抗血清Multi-class antibodies規(guī)格: 1ml
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,,剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,;
3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL,;空白孔不加,。
4.除空白孔外,,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體,吸水紙上拍干,,每孔加滿洗滌液(350μL),,靜置1min,,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板),。
6.每孔加入底物A、B各50μL,,37℃避光孵育15min,。產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),,在450nm波長處測(cè)定各孔的OD值,。