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詳細(xì)介紹
實(shí)時熒光定量PCR：
實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中,，通過對每個樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此,，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期）,，此時微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增,，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,，因此,，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的,、值得信賴的科學(xué)方法,。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性定量方法,，已得到,，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,，藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實(shí)物保存,。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
犬布氏桿菌PCR檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
下列相關(guān)產(chǎn)品：
脆弱擬桿菌PCR檢測試劑盒 Bacteroides fragilisPCR
擬桿菌屬通用PCR檢測試劑盒 Bacteroides spp.PCR
中腸腺壞死桿狀病毒PCR檢測試劑盒 Baculoviral Midgut Gland Necrosis Type Virus (BMNV)PCR
PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中,，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,，不加或添加石蠟油,。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min,，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min,。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,，以除去石蠟油,；否則，直接取5-10μl電泳檢測,。
定量PCR方法：
a,、競爭法 產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）,。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,，而待測模板不被酶切,，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度,，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記,。在模板擴(kuò)增的同時,，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度,，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板,。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物,，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),，若加入內(nèi)標(biāo),，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加,。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6.每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。
7.每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值,。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
大鼠硝基酪酸()ELISA試劑盒 ,，英文名： ELISA Kit
Mouse heat shock protein 90 (HSP-90) ELISA Kit 小鼠熱休克蛋白90(HSP-90)ELISA試劑盒
MouseCoicosterone,COELISAKit 小鼠皮質(zhì)酮/腎上腺酮(CO)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
CLIAKitforHumanankyrinB,Ank-BELISAKit人錨蛋白B規(guī)格：48T/96T
細(xì)胞GSK3激酶總活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次
ELISAKitE3大鼠雌三醇規(guī)格：48T/96T
小鼠熱休克轉(zhuǎn)錄因子4(HSF4)ELISA試劑盒 ，英文名： HSF4 ELISA Kit
豬瘦素(LEP)ELISA檢測試劑盒PorcineLeptin,LEPELISAKit 96T/48T
大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β2受體(TGF-β2R)免疫試劑盒 Rat ansforming growth factor β2 receptor,TGF-β2R ELISA Kit
英文名稱HumanIerleukin-16ELISAKIT人白介素-16(IL-16)規(guī)格：96T/48T
動物源性食品羊源試劑盒20次
RatVitaminD2,VD2ELISA試劑盒大鼠D2(VD2)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
犬布氏桿菌PCR檢測試劑盒Anti-IL-16/FITC 熒光素標(biāo)記白介素16抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
Rabbit Anti-human sIgA/FITC 熒光素標(biāo)記兔抗人分泌型IgA抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
Rhesus antibody Rh Apg12 自噬相關(guān)蛋白12抗體 規(guī)格 0.2ml
Rabbit Anti-rat IgG/RBITC 羅丹明標(biāo)記的兔抗大鼠IgG 0.3ml
GIMAP6 英文名稱： GTP酶IMAP家族成員6抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh Rabbit Anti-human sIgA/Alexa Fluor 350 Alexa Fluor 350標(biāo)記的兔抗人分泌型IgA 規(guī)格 0.1ml
Rabbit Anti-human sIgA/FITC 熒光素標(biāo)記兔抗人分泌型IgA抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
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