詳細介紹
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存,。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
花生PCR檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中,。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,,不加或添加石蠟油。
2:調(diào)整好反應程序,。將上述混合液稍加離心,,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增,。一般:在93℃預變性3-5min,,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,,在72℃ 保7min,。
3:伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4:PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,,需用100μl進行抽提反應混合液,以除去石蠟油,;否則,,直接取5-10μl電泳檢測。
下列相關(guān)產(chǎn)品:
潰瘍分枝桿菌PCR檢測試劑盒 Mycobacterium ulceransPCR
闊盤吸蟲通用PCR檢測試劑盒 Eurytrema spp.PCR
拉蒂諾病毒PCR檢測試劑盒 Latino virus(LATV)RTPCR
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,,并記錄在電腦軟件之中,,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果,。因此,,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),,此時微小誤差尚未放大,,因此Ct值的重現(xiàn)性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,,得到的Ct值是恒定的,。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,,因此,,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的,、值得信賴的科學方法,。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現(xiàn)性定量方法,,已得到,,廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究,,藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
定量PCR方法:
a,、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板,。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記),。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。
b,、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,內(nèi)標用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標記,,下游引物不標記。在模板擴增的同時,,內(nèi)標也被擴增,。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標為對照定量待檢測模板,。
c,、PCR-ELISA法
利用di高辛等標記引物,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合,,再加入抗di高辛酶標抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,,若加入內(nèi)標,,作出標準曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的,。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品:
大鼠抗胰島細胞抗體(ICA)ELISA試劑盒 ,,英文名: ICA ELISA Kit
Mouse mucin / mucin 5AC (MUC5AC) ELISA Kit 小鼠粘蛋白/粘液素5AC(MUC5AC)ELISA試劑盒
RatiactParathormone,i-PTHELISAKit 大鼠全段甲狀旁腺素(i-PTH)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝
CLIAKitforFS(MouseFollistatin)ELISAKit小鼠卵泡抑素規(guī)格:48T/96T
細胞環(huán)氧化酶(CYCLOOXYGENASE-2)活性熒光定量檢測試劑盒20次
Ratplasminogenactivatorinhibitor,PAIELISAKit大鼠纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
小鼠酶2(CA-2)ELISA試劑盒 ,英文名: CA-2 ELISA Kit
小鼠巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)ELISA檢測試劑盒MouseMacrophageColony-StimulatingFactor,M-CSFELISAkit 96T/48T
人骨成型蛋白15(BMP-15/GDF-9B)免疫試劑盒 Human BMP-15 ELISA kit
RatFreeProstateSpecificAigen,fPSAELISAKit大鼠游離前列腺特異性抗原(fPSA)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
ANDROGEECEPTOR蛋白表達ELISA定量檢測試劑盒25次
MouseHeatShockFactor1,HSF1ELISA試劑盒小鼠熱休克因子1(HSF1)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
花生PCR檢測試劑盒Anti-PTGEs/FITC 熒光素標記前列腺素E合成酶抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
THY (thyroglobulin,TG) 甲狀腺球蛋白Multi-class antibodies規(guī)格: 10mg
胰島素受體底物-4抗體 Anti-IRS-4 0.2ml
Goat anti-Mouse IgM whole serum 羊抗小鼠IgM抗血清 1ml
Ferritin Light Chain 英文名稱: 鐵蛋白輕鏈抗體 0.1ml
Rhesus antibody Rh phospho-PRKAB1(Ser182) 0酸化腺苷單0酸活化蛋白激酶β1抗體 規(guī)格 0.1ml
THY (thyroglobulin,TG) 甲狀腺球蛋白Multi-class antibodies規(guī)格: 10mg
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,,剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設(shè)置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,;
3.樣本孔中加入待測樣本50μL,;空白孔不加。
4.除空白孔外,,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體,,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),,靜置1min,,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板),。
6.每孔加入底物A、B各50μL,,37℃避光孵育15min,。產(chǎn)品僅用于科研實驗
7.每孔加入終止液50μL,,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值,。