操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實(shí)物保存,。

PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中,，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl     dNTP mix （2mM）
4 μl     引物1（10pM）
2 μl     引物2（10pM）
2 μl     Taq酶 （2U/μl）
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl      加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,，不加或添加石蠟油,。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min,，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min,。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油,，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,，以除去石蠟油；否則,，直接取5-10μl電泳檢測,。
下列相關(guān)產(chǎn)品：
豬副粘病毒PCR檢測試劑盒 Porcine paramyxovirusRTPCR

豬生殖與呼吸綜合癥病毒歐洲株PCR檢測試劑盒 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Europe Strain (PRRSV Europe)RTPCR

豬生殖與呼吸綜合癥病毒美洲株PCR檢測試劑盒 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus North America Strain(PRRSV NA)
實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中,，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期）,，此時(shí)微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,，因此,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法,。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性定量方法，已得到,，廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領(lǐng)域,。
定量PCR方法：
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板,。在同一反應(yīng)管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,，分別測定熒光強(qiáng)度,，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b,、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,，下游引物不標(biāo)記,。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板,。
c,、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物,，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),，若加入內(nèi)標(biāo),，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
MIP-2 大鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2Multi-class antibodies規(guī)格： 48T

Anti-E2F5 轉(zhuǎn)錄因子E2F-5抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.2ml

Rhesus antibody Rh NALP2/PAN1/PYPAF2 富含亮重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白2抗體 規(guī)格 0.1ml

Human 2,3-dinor thromboxane B2,2,3-dinor-TXB2 ELISA Kit 人2,3Dinor血栓烷B2 96T

Supervillin 英文名稱： 監(jiān)理蛋白抗體 0.1ml

CXCR5 英文名稱： 細(xì)胞表面趨化因子受體5抗體 0.1ml

Anti-E2F5 轉(zhuǎn)錄因子E2F-5抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.2ml

IgM/PE-Cy3 PE-Cy3標(biāo)記的羊抗小鼠IgM 0.1ml

FLT3L： FMS樣酪酸激酶3配體抗體 0.2ml

心肌肌鈣蛋白抗體 anti-CTn1 0.1ml

Anti-Phospho-p63 (Ser395) /FITC 熒光素標(biāo)記0酸化P63抑制基因抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml

Rhesus antibody Rh Phospho-YAP1(Ser127) 0酸化原癌基因Yes相關(guān)蛋白1抗體 規(guī)格 0.1ml

IgG/Biotin 化兔抗馬IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.1ml
伊氏錐蟲PCR檢測試劑盒小鼠牛血清白蛋白(BSA)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

Rat methylase ELISA Kit (Methylase) 大鼠甲基化酶(Methylase)ELISA試劑盒

Humandynamin2,DNM2ELISAKit 人發(fā)動蛋白2(DNM2)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

Human11-dehydro-thromboxaneB2,11-DH-TXB2ELISA試劑盒人11去氫血栓烷B2(11-DH-TXB2)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

真菌/酵母細(xì)胞線粒體分離(活性)試劑盒10次

MouseAquaporin4,AQP-4ELISAKit小鼠水通道蛋白4(AQP-4)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加。
4.除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6.每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
7.每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。