詳細介紹
操作流程
收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存,。
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 規(guī)格 |
布氏羅得西亞錐蟲PCR檢測試劑盒 | Trypanosoma brucei rhodesiensePCR | 50T |
PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油,。
2:調(diào)整好反應程序,。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,,執(zhí)行擴增,。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,,循環(huán)30-35次,,在72℃ 保7min,。
3:伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應,,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4:PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,,需用100μl進行抽提反應混合液,,以除去石蠟油,;否則,直接取5-10μl電泳檢測,。
下列相關產(chǎn)品:
脊髓灰質(zhì)炎病毒型PCR檢測試劑盒 Poliovirus 3 (PV3)3RTPCR
脊髓灰質(zhì)炎病毒通用型PCR檢測試劑盒 Poliovirus(PV)RTPCR
豬腺病毒PCR檢測試劑盒 Porcine Adenovirus(Swine Adenovirus)PCR
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,,通過對每個樣品Ct值的計算,,根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此,,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,,因此Ct值的重現(xiàn)性,,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,得到的Ct值是恒定的,。
2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系,,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法,。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法,。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,,重現(xiàn)性定量方法,已得到,,廣泛用于基因表達研究,、轉(zhuǎn)基因研究,,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域,。
定量PCR方法:
a,、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記),。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,,而待測模板不被酶切,,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,,內(nèi)標用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標記,下游引物不標記,。在模板擴增的同時,,內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,,以內(nèi)標為對照定量待檢測模板,。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛等標記引物,,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合,,再加入抗di高辛酶標抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,,若加入內(nèi)標,作出標準曲線,,也可實現(xiàn)定量檢測目的,。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品:
DA 大鼠多巴胺Multi-class antibodies規(guī)格: 48T
Anti-phospho-eIF4E(Ser209) 0酸化真核翻譯起始因子4E抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml
Rhesus antibody Rh Mycobacterium 結(jié)核分枝桿菌抗體 規(guī)格 0.2ml
PA(Human prealbumin) ELISA Kit 人前白蛋白 96T
SYF2 英文名稱: SYF2蛋白抗體 0.2ml
Caspase-1 p20 英文名稱: 天冬酸-胱酸特異性家族抗體 0.1ml
Anti-phospho-eIF4E(Ser209) 0酸化真核翻譯起始因子4E抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.1ml
IgM/PE-Cy7 PE-Cy7標記的羊抗小鼠IgM 0.1ml
FIP1L1: 高嗜酸性粒細胞綜合癥相關蛋白FIP1L1抗體 0.2ml
間隙連接蛋白43抗體 Anti-Cx43 0.1ml
Anti-p70 S6 Kinase Beta2/P70 Beta2/FITC 熒光素標記核糖體S6蛋白激酶β2抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
Rhesus antibody Rh Phospho-Wee1(Ser123) 0酸化WEE1蛋白抗體 規(guī)格 0.1ml
IgG/Biotin 化兔抗猴IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.1ml
布氏羅得西亞錐蟲PCR檢測試劑盒小鼠膀胱抗原(BTA)ELISA試劑盒 ,英文名: BTA ELISA Kit
小鼠Ⅱ型膠原(ColⅡ)ELISA檢測試劑盒MouseCollageypeⅡ,ColⅡELISAKit 96T/48T
人肺炎衣原體抗體IgA(Cpn-IgA)免疫試劑盒 Human Cpn-IgA ELISA Kit
RatLeptinSolubleReceptor,sLRELISAKit大鼠可溶性瘦素受體(sLR)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
COLLAGENII蛋白表達ELISA定量檢測試劑盒25次
Mousemyeloperoxidase-aineuophilcytoplasmicaibodyIgG,MPO-ANCAIgGELISA試劑盒小鼠髓過氧化物酶特異性抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體IgG(MPO-ANCAIgG)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,,剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,;
3.樣本孔中加入待測樣本50μL,;空白孔不加。
4.除空白孔外,,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體,,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),,靜置1min,,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板),。
6.每孔加入底物A、B各50μL,,37℃避光孵育15min,。產(chǎn)品僅用于科研實驗
7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),,在450nm波長處測定各孔的OD值,。