實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,，實現了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,，并記錄在電腦軟件之中,，通過對每個樣品Ct值的計算,，根據標準曲線獲得定量結果,。因此,，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期）,，此時微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現性，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系,，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此,，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法,。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法,。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,，重現性定量方法，已得到,，廣泛用于基因表達研究,、轉基因研究，藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領域,。

操作流程
收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質粒抽提——>質粒測序——>測序結果分析——>克隆信息輸入數據庫——>質粒實物保存。

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PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中,，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中,。
10×PCR buffer
5 μl     dNTP mix （2mM）
4 μl     引物1（10pM）
2 μl     引物2（10pM）
2 μl     Taq酶 （2U/μl）
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl      加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油,。
2：調整好反應程序,。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴增,。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次,，在72℃ 保7min。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結束反應,，PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4：PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μl進行抽提反應混合液,，以除去石蠟油,；否則，直接取5-10μl電泳檢測,。

定量PCR方法：
a,、競爭法　　產品僅用于科研實驗
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）,。擴增后用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,，而待測模板不被酶切,，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開,，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數,。
b,、內參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標記,，下游引物不標記。在模板擴增的同時,，內標也被擴增,。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同,，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板,。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標記引物,，擴增產物被固相板上特異的探針所結合,，再加入抗di高辛酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗,，若加入內標，作出標準曲線,，也可實現定量檢測目的,。

操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加,。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL,，15min內,，在450nm波長處測定各孔的OD值。

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