詳細介紹
實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,,并記錄在電腦軟件之中,,通過對每個樣品Ct值的計算,,根據標準曲線獲得定量結果,。因此,,實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),,此時微小誤差尚未放大,,因此Ct值的重現(xiàn)性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增,,得到的Ct值是恒定的,。
2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,,因此,,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的,、值得信賴的科學方法,。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現(xiàn)性定量方法,,已得到,,廣泛用于基因表達研究、轉基因研究,,藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領域。
操作流程
收集基因信息——>設計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質粒抽提——>質粒測序——>測序結果分析——>克隆信息輸入數(shù)據庫——>質粒實物保存,。
產品名稱 | 英文名稱 | 規(guī)格 |
豬滑液支原體PCR檢測試劑盒 | Mycoplasma hyosynoviaePCR | 50T |
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PCR實驗方法步驟:
方法
1:在冰浴中,,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,,不加或添加石蠟油,。
2:調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,,立即置PCR儀上,,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,,循環(huán)30-35次,,在72℃ 保7min。
3:伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結束反應,,PCR產物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4:PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μl進行抽提反應混合液,,以除去石蠟油,;否則,直接取5-10μl電泳檢測,。
定量PCR方法:
a,、競爭法 產品僅用于科研實驗
選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記),。擴增后用內切酶消化PCR產物,競爭性模板的產物被酶解為兩個片段,,而待測模板不被酶切,,可通過電泳或高效液相將兩種產物分開,分別測定熒光強度,,根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。
b、內參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物,,內標用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標記,下游引物不標記,。在模板擴增的同時,,內標也被擴增。在PCR產物中,,由于內標與靶模板的長度不同,,二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,,以內標為對照定量待檢測模板,。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛等標記引物,,擴增產物被固相板上特異的探針所結合,,再加入抗di高辛酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,,最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內標,,作出標準曲線,,也可實現(xiàn)定量檢測目的,。
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設置標準品孔和樣本孔,,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;
3.樣本孔中加入待測樣本50μL,;空白孔不加,。
4.除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,,用封板膜封住反應孔,,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體,,吸水紙上拍干,,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,,甩去洗滌液,,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板),。
6.每孔加入底物A,、B各50μL,37℃避光孵育15min,。
7.每孔加入終止液50μL,,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值,。
下列是公司正在銷售的產品:
OAT4L又稱URAT1 (Urate Transporter 1) 尿酸鹽重吸收轉運子1 (抗原)Multi-class antibodies規(guī)格: 0.5mg
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