實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中,，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現(xiàn)性,，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法,。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性定量方法，已得到,，廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核,、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域,。

操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽(yáng)性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測(cè)序——>測(cè)序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫(kù)——>質(zhì)粒實(shí)物保存。

下列相關(guān)產(chǎn)品：
亮熱厲螨PCR檢測(cè)試劑盒

鄰單胞菌通用探針?lè)晒舛?span>PCR試劑盒

淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒PCR檢測(cè)試劑盒

淋病奈瑟菌探針?lè)晒舛?span>PCR試劑盒

PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中,，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中,。
10×PCR buffer
5 μl     dNTP mix （2mM）
4 μl     引物1（10pM）
2 μl     引物2（10pM）
2 μl     Taq酶 （2U/μl）
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl      加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油,。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴(kuò)增,。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次,，在72℃ 保7min。
3：伴放線放線桿菌探針?lè)晒舛?span>PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存,。
4：PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,，以除去石蠟油,；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

定量PCR方法：
a,、競(jìng)爭(zhēng)法　　產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板,。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）,。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切,，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi),，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù),。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記,。在模板擴(kuò)增的同時(shí),，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板,。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物,，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的,。

操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL,；空白孔不加,。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
Human arabinogalactan proteins,AGPs ELISA Kit 人阿拉伯半乳糖蛋白Multi-class antibodies規(guī)格： 48T

Anti-phospho-Src(Tyr529) 0酸化Src原癌基因抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.1ml

Rhesus antibody Rh Goat Anti-human IgM/RBITC 羅丹明標(biāo)記的羊抗人IgM 規(guī)格 0.3ml

B7-2/sCD86 ELISA Kit 大鼠可溶性CD86 96T

TrkB 英文名稱： 酪酸激酶B抗體 0.1ml

BECN1L1 英文名稱： Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域樣蛋白1抗體 0.2ml

Anti-phospho-Src(Tyr529) 0酸化Src原癌基因抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.1ml

STK3： 絲酸/蘇酸蛋白激酶3抗體 0.2ml

Phospho-ELk1(Thr417)： 0酸化細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ELK1抗體 0.1ml

陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)器1抗體 Anti-OCT1 0.2ml

Anti-Phospho-Smad3 (Ser423/425) /FITC 熒光素標(biāo)記0酸化細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD3抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml

Rhesus antibody Rh Phospho-NPM (Thr199) 0酸化核仁0酸蛋白抗體 規(guī)格 0.1ml

CD31 (PECAM-1) 血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(抗原)Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
差異支原體PCR檢測(cè)試劑盒小鼠細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS-3)ELISA試劑盒 ,，英文名： SOCS-3 ELISA Kit

小鼠可溶性肌球蛋白重鏈1(sMHC-1)Elisa檢測(cè)試劑盒Mousesolublemyosinheavychain1,sMHC-1ELISAKit 96T/48T

人黑色素免疫試劑盒 Human melanin ELISA kit

RatCystatinC,Cys-CELISAKit大鼠半胱抑制劑/胱抑素C(Cys-C)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

3′端DNA轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記試劑盒10次

MousedipeptidylpeptldaseⅣ,DPPⅣELISA試劑盒小鼠二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T