實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限,，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期）,，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性,，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系,，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的,、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性定量方法,，已得到，廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究,，藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實(shí)物保存,。

下列相關(guān)產(chǎn)品：
天花病毒PCR檢測試劑盒

田鼠布魯氏菌PCR檢測試劑盒

田鼠痘病毒PCR檢測試劑盒

田鼠分枝桿菌PCR檢測試劑盒

PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中,，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl     dNTP mix （2mM）
4 μl     引物1（10pM）
2 μl     引物2（10pM）
2 μl     Taq酶 （2U/μl）
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl      加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,，不加或添加石蠟油,。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min,，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min,。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油,，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油,；否則,，直接取5-10μl電泳檢測。

定量PCR方法：
a,、競爭法　　產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板,。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）,。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切,，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù),。
b,、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標(biāo)記,，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,，分別測定其熒光強(qiáng)度,，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
c,、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物,，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物,，最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo),，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。

操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加。
4.除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL）,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。
6.每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
Inhibin Alpha 抑制素α抗原Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg

Anti-AEV(Avian Encephalomyelitis virus) 禽腦脊髓炎病毒AEV抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.2ml

Rhesus antibody Rh phospho-Cdc25B (Ser149) 0酸化細(xì)胞分裂周期蛋白25B抗體 規(guī)格 0.1ml

溴化已錠染色液 -紅色 1ml Sigma原料,自產(chǎn)

Wnt1 英文名稱： 信號通路Wnt1抗體 0.1ml

Dynorphin A 英文名稱： 腦啡肽A抗體 0.2ml

Anti-AEV(Avian Encephalomyelitis virus) 禽腦脊髓炎病毒AEV抗體Multi-class antibodies規(guī)格： 0.2ml

phospho-ZCWCC1 (Ser739)： 0酸化ZCWCC1抗體 0.1ml

DSPP： 牙本質(zhì)0蛋白抗體 0.1ml

APP淀粉樣肽前體蛋白抗體 Anti-APP/Amyloid beta A4 0.1ml

Anti-AFP/HRP 辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗人甲胎蛋白單克隆抗體(檢測)IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml

Rhesus antibody Rh Phospho-eNOS(Thr495) 0酸化合成酶3抗體(內(nèi)皮型) 規(guī)格 0.1ml

Nadrin peptide 發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白多肽抗原Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
長鼻分咽線蟲PCR檢測試劑盒小鼠真核翻譯起始因子2α激酶3(EIF2αK3)ELISA試劑盒 ，英文名： EIF2αK3 ELISA Kit

乙酰受體抗體(AChRab)ELISA檢測試劑盒Monkeyacetylcholinereceptoraibody,AChRabELISAKit 96T/48T

犬內(nèi)毒素(ET)免疫試劑盒 Canine endotoxin,ET ELISA Kit

英文名稱HumanInsulinELISAKit人胰島素(Insulin)ELISAKit規(guī)格：96T/48T

化微粒體0脂酶D(PhospholipaseD)總活性比色法定量檢測試劑盒20次

RatImmunoglobulinA,IgAELISA試劑盒大鼠免疫球蛋白A(IgA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T