操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實(shí)物保存,。
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 規(guī)格 |
指環(huán)蟲屬通用PCR檢測試劑盒 | Dactylogyrus spp.PCR | 50T |

PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:
方法
1:在冰浴中,,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,,不加或添加石蠟油,。
2:調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,,立即置PCR儀上,,執(zhí)行擴(kuò)增,。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,,循環(huán)30-35次,,在72℃ 保7min。
3:伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存,。
4:PCR的電泳檢測:如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,,以除去石蠟油,;否則,直接取5-10μl電泳檢測,。
下列相關(guān)產(chǎn)品:
嗜吞噬細(xì)胞無漿體PCR檢測試劑盒
嗜血桿菌通用PCR檢測試劑盒
嗜衣原體通用PCR檢測試劑盒
匙形古柏線蟲PCR檢測試劑盒
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限,,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,,通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),,剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,,因此Ct值的重現(xiàn)性,,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的,。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測定,因此,,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法,。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,,重現(xiàn)性定量方法,,已得到,,廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,,藥物療效考核,、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
定量PCR方法:
a,、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板,。在同一反應(yīng)管中,,待測樣品與競爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,,分別測定熒光強(qiáng)度,,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b,、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,,下游引物不標(biāo)記,。在模板擴(kuò)增的同時(shí),內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中,,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,,分別測定其熒光強(qiáng)度,,以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測模板。
c,、PCR-ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物,,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,,最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),,作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品:
HLA-DR(human leukoyte Antigen DR) HLA-DR抗原Multi-class antibodies規(guī)格: 0.5mg
Anti-A2AR 腺苷A2A受體抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
Rhesus antibody Rh phospho-CK II beta(Ser209) 0酸化絲/蛋白激酶II β(casein kinase IIβ)抗體 規(guī)格 0.1ml
羊抗人IgA血清 0.5ml 國產(chǎn)
WRB 英文名稱: 色酸豐富蛋白抗體 0.2ml
DAT 英文名稱: 多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DAT抗體 0.1ml
Anti-A2AR 腺苷A2A受體抗體Multi-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
phospho-Stathmin 1 (Ser24): 0酸化原癌基因蛋白18抗體 0.1ml
Eppin: 附睪抑制蛋白 0.2ml
腺苷酸環(huán)化酶激活肽-27/38抗體 Anti-PACAP-27/38 0.2ml
Anti-SP-D/FITC 熒光素標(biāo)記肺表面活性蛋白D抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格: 0.2ml
Rhesus antibody Rh Phospho-NFKB1(Ser907) 0酸化細(xì)胞核因子p50/k基因結(jié)合核因子抗體 規(guī)格 0.1ml
ERAB 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Aβ相關(guān)結(jié)合蛋白(抗原)Multi-class antibodies規(guī)格: 0.5mg
指環(huán)蟲屬通用PCR檢測試劑盒小鼠脂多糖(LPS)ELISA試劑盒 ,,英文名: LPS ELISA Kit
腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體3(AIL-R3)ELISA檢測試劑盒Monkeytumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand3,AIL-R3ELISAKit 96T/48T
犬皮質(zhì)酮/腎上腺酮(CO)免疫試劑盒 Canine Coicosterone,CO ELISA Kit
英文名稱HumanProinsulinELISAKit人胰島素原(PI)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
化大鼠腎上腺髓質(zhì)素(AM)基因重組表達(dá)載體(pGEFP-AM)測序引物對(duì)2OD
Rathiston-H2bELISA試劑盒大鼠組蛋白H2b(histon-H2b)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,;
3.樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加,。
4.除空白孔外,,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5.棄去液體,,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),,靜置1min,,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板),。
6.每孔加入底物A、B各50μL,,37℃避光孵育15min,。產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),,在450nm波長處測定各孔的OD值,。