實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期）,，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性,，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法,。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的,、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性定量方法,，已得到，廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究,，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

產(chǎn)品名稱：PCR檢測(cè)試劑盒
規(guī)格：50T
分類：PCR檢測(cè)試劑盒
儲(chǔ)存條件：-20℃避光保存,，避免反復(fù)凍融,。
運(yùn)輸：低溫、避光,，快遞免費(fèi)送貨上門,。

操作流程

收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽(yáng)性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測(cè)序——>測(cè)序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫(kù)——>質(zhì)粒實(shí)物保存。

ⅣD組磷脂酶A2(PLA2G4D)重組蛋白

高溫需求因子A4(HTRA4)重組蛋白

ⅫB組磷脂酶A2(PLA2G12B)重組蛋白

解整合素金屬蛋白酶33(ADAM33)重組蛋白

PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法

1：在冰浴中,，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中,。

10×PCR buffer

5 μl     dNTP mix（2mM）

4 μl引物1（10pM）

2 μl引物2（10pM）2 μl     Taq

酶 （2U/μl）1 μl     DNA

模板（50ng-1μg/μl）

1 μl加ddH2O至 50 μl

視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油,。

2：調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上,，執(zhí)行擴(kuò)增,。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,，循環(huán)30-35次,，在72℃ 保7min。

定量PCR方法：

a,、競(jìng)爭(zhēng)法　　產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）,。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,，而待測(cè)模板不被酶切,，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù),。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來(lái),，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板,。

c,、PCR－ELISA法

利用di高辛等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的,。操作流程:

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL,；空白孔不加,。

4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

6.每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。

7.每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：

二氫二醇脫氫酶2(DDH2)重組蛋白

醛糖還原酶相似蛋白1(ARL1)重組蛋白

蛋白酶23(PRSS23)重組蛋白

核糖核酸酶A10(RNASE10)重組蛋白

肽酶抑制因子16(PI16)重組蛋白

環(huán)氧化合物水解酶4(EPHX4)重組蛋白

輔酶Q10同源物B(COQ10B)重組蛋白

羧酸酯酶5A(CES5A)重組蛋白

脫羧酶樣蛋白1(GADL1)重組蛋白

透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶1(HYAL1)重組蛋白

絲蛋白酶33(PRSS33)重組蛋白

二氫二醇脫氫酶2(DDH2)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

醛糖還原酶相似蛋白1(ARL1)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

蛋白酶23(PRSS23)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human，人)

核糖核酸酶A10(RNASE10)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

肽酶抑制因子16(PI16)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

環(huán)氧化合物水解酶4(EPHX4)重組蛋白 物種：Mus musculus (Mouse，小鼠)

輔酶Q10同源物B(COQ10B)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

羧酸酯酶5A(CES5A)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

脫羧酶樣蛋白1(GADL1)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human，人)

透明質(zhì)酸氨基葡糖苷酶1(HYAL1)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

蛋白酶33(PRSS33)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

RIO激酶1(RIOK1)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human，人)

NADH脫氫酶5(ND5)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

核糖核酸酶A12(RNASE12)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)重組蛋白 物種：Bos taurus; Bovine (Cattle，牛)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)重組蛋白 物種：Mus musculus (Mouse,，小鼠)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)重組蛋白 物種：Sus scrofa; Porcine (Pig，豬)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)重組蛋白 物種：Rattus norvegicus (Rat,，大鼠)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)重組蛋白 物種：Oryctolagus cuniculus (Rabbit,，兔)

腦膜瘤表達(dá)抗原5(MGEA5)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human，人)

腦膜瘤表達(dá)抗原5(MGEA5)重組蛋白 物種：Mus musculus (Mouse,，小鼠)

腦膜瘤表達(dá)抗原5(MGEA5)重組蛋白 物種：Rattus norvegicus (Rat,，大鼠)

基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)重組蛋白 物種：Bos taurus; Bovine (Cattle，牛)

基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)重組蛋白 物種：Canis familiaris; Canine (Dog,，犬)

基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)重組蛋白 物種：Capra hircus; Caprine (Goat,，山羊)

PCR檢測(cè)試劑盒基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)重組蛋白 物種：Equus caballus; Equine (Horse，馬)

基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)重組蛋白 物種：Chicken (Gallus,，雞)

基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)重組蛋白 物種：Homo sapiens (Human,，人)