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上海仁捷生物科技有限公司
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牛胰高血糖素（GC）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測(cè)定牛血清,、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中胰高血糖素（GC）的含量。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中牛胰高血糖素（GC）水平,。用純化的牛胰高血糖素（GC）捕獲抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入牛胰高血糖素（GC）,，再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的牛胰高血糖素（GC）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中牛胰高血糖素（GC）含量,。
試劑盒組成：
試劑盒組成
48孔配置
96孔配置
保存
說(shuō)明書(shū)
1份
1份
封板膜
2片
2片
密封袋
1個(gè)
1個(gè)
酶標(biāo)包被板
1×48
1×96
2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品
0.3ml×6管
0.3ml×6管
2-8℃保存
酶標(biāo)試劑
5 ml×1瓶
10 ml×1瓶
2-8℃保存
樣品稀釋液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑A液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
顯色劑B液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
終止液
3 ml×1瓶
6 ml×1瓶
2-8℃保存
20×濃縮洗滌液
15ml×1瓶
25ml×1瓶
2-8℃保存
注：標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：400,、200、100,、50,、25,、0 pg/mL.
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心,。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心,。
3. 尿液：用無(wú)菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行,。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。保存過(guò)程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱(chēng)取重量,。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè),，其余冷凍備用,。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；。
加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）,、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,。
加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外,。
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘,。
配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。
顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.
終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。
測(cè)定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）,。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。
底物請(qǐng)避光保存,。
嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異,，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn),。
計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo),，
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),，根據(jù)樣品的OD
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋
倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)
準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式,，將樣品的OD值
代入方程式，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋
倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線(xiàn)性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上,。
2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% ,。
檢測(cè)范圍：
12.5 pg/mL - 400 pg/mL
靈敏度：
zui低檢測(cè)濃度小于1.0 pg/mL
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存： 2-8℃,。
2．有效期： 6個(gè)月
