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豬雄烯酮（ADT）ELISA試劑盒-競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)原理
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。在預(yù)包被抗豬雄烯酮（ADT）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入豬雄烯酮（ADT）校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本,，再加入HRP標(biāo)記的豬雄烯酮（ADT）抗原（酶標(biāo)抗原），經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌,，去除未結(jié)合的組分,，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標(biāo)抗原的免疫復(fù)合物。加底物A和B,，底物在HRP催化下,，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下,，最終轉(zhuǎn)化為黃色,，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中豬雄烯酮（ADT）的濃度負(fù)相關(guān),。擬合校準(zhǔn)品曲線,，可以計(jì)算出樣本中豬雄烯酮（ADT）的濃度。
試劑盒限制性
1,、 僅供科研使用,，不得用于臨床診斷。
2,、 在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用,，過(guò)期產(chǎn)品不得使用。
3,、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用,。
4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液,。
5,、 如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后,，再重新測(cè)定,。
6、 待測(cè)樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果,，檢測(cè)前,，請(qǐng)排出該因素。
7,、 通過(guò)其他方法得到的檢測(cè)結(jié)果,，與本試劑盒測(cè)定結(jié)果不具有直接的可比性,。
技術(shù)提示
1、 混合蛋白溶液時(shí),，避免起泡,。
2、 加校準(zhǔn)品與樣本時(shí),，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭,，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染,。
3,、 合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟,，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件,。
4、 使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí),，加入一個(gè)30秒浸泡的步驟,，可以提高檢測(cè)精度。
5,、 底物溶液為無(wú)色液體,，保存過(guò)程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效,，不得使用,。
6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,，加入終止液后,，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會(huì)瞬間變?yōu)辄S色,。
7、 實(shí)驗(yàn)中,，用剩的板條,，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。
8,、 所有液體組分，使用前充分搖勻,，嚴(yán)格按照說(shuō)明書標(biāo)明的時(shí)間,、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。
試劑盒組分與保存
未開封的試劑盒保存在2-8度,，不得使用過(guò)期試劑盒,。
組分 | 數(shù)量 | 主要成分 | 開封后儲(chǔ)存 |
校準(zhǔn)品 | 0.3ml/管 | -- | 2-8℃14天 |
包被微孔板 | 96T/48T | 預(yù)包被固相抗體 | 2-8℃14天 |
HRP標(biāo)記抗原 | 10mL | HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗原 | 2-8℃180天 |
底物液A | 6mL | 0.01%過(guò)氧化氫 | 2-8℃180天 |
底物液B | 6mL | 0.1%TMB | 2-8℃180天 |
終止液 | 6mL | 2mol/L稀硫酸 | 2-8℃180天 |
樣本稀釋液 | 6mL | PBS | 2-8℃180天 |
20×濃縮洗滌液 | 25mL | 0.05%Tween20 | 2-8℃180天 |
說(shuō)明書 | 1份 | -- | -- |
自封袋 | 1個(gè) | -- | -- |
不干膠 | 2片 | -- | -- |
標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：12、6、3,、1.5,、0.75、0 nmol/L.
操作程序
所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫,，標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔,。
1,、 按前面說(shuō)明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液,。
2,、 從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱,。
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,，空白孔不加,，樣本孔加待測(cè)樣本50μL。
3,、除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL,。
1,、 用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
2,、 揭開封板膜，棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置20S,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次,。若使用自動(dòng)洗板機(jī),，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡30s的程序,，可以提高檢測(cè)的精度,。洗板結(jié)束,，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上,，充分拍干反應(yīng)板,。
3、 將底物A和B按1:1體積充分混合,，所有孔中加入底物混合液100μL,。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min,。
4,、 所有孔加入終止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）,。
結(jié)果計(jì)算
1,、 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為縱坐標(biāo),，利用計(jì)算機(jī)軟件,，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,，通過(guò)樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計(jì)算樣品的濃度值。
2,、 如果樣品被稀釋,，通過(guò)上述方法測(cè)的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù),，才是樣品的最終濃度,。
試劑盒性能指標(biāo)
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明,、無(wú)沉淀或者絮狀物,。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無(wú)破損漏氣,。
2,、劑量反應(yīng)曲線線性
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900,。
3,、精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高,、中,、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估,。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%,。
批間精密度：三組已知的高,、中、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估,。批間變異系數(shù)CV%小于15%。
4,、靈敏度
檢出劑量小于0.1 nmol/L,。
5、回收率
三組已知的高,、中,、低濃度樣品，進(jìn)行五次在同一個(gè)板塊內(nèi)回收率評(píng)估,，回收率在85%-115%之間,。
6、特異性
本試劑盒識(shí)別天然和重組豬雄烯酮（ADT）,，與結(jié)構(gòu)類似物無(wú)交叉,。
7、穩(wěn)定性
2℃-8℃保存,，有效期6個(gè)月,。
5、 檢測(cè)范圍
0.375 nmol/L - 12 nmol/L
