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人胰島素原(PI)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明

PI簡介：

胰島素原(PI)是胰島素的前體激素，它是由由胰島β細胞合成和分泌,，主要在腎臟分解代謝,。生理情況下，只有極少量的胰島素原釋放入血，在病理情況下,，胰島β細胞釋放胰島素原增多,，血中胰島素原水平升高。它是細胞在裂解成成熟胰島素之前分泌的最后一個單鏈蛋白結(jié)構(gòu),。它是由芝加哥大學的Donald F. Steiner教授在1967年發(fā)現(xiàn)的。

實驗原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被有人胰島素原（PI）捕獲抗體的微孔中,，依次加入樣本、標準品,、生物素標記的檢測抗體,，HRP酶結(jié)合物，中間經(jīng)過溫育和洗滌,，用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人胰島素原（PI）呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。

試劑盒組成：

試劑盒參數(shù)：

需自備的設備及試劑： 

1. 450±10nm 濾光片酶標儀

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準備若干個標準品稀釋管.

樣本稀釋方案：

請?zhí)崆邦A估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測樣本需要稀釋 ,，參考稀釋方案如下：

稀釋 100 倍 ：一步稀釋,。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 100 倍稀釋,；

稀釋 1000 倍： 兩步稀釋 ,。 取 5μL 樣本到 95μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 20 倍稀 釋 ,，再取 5μL 20 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ,，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 1000 倍,；

稀釋 100000 倍 ：三步稀釋,。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 40 倍 稀釋 ,，再取 5μL 40 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ,，做 50 倍稀釋 ，最后 取 5μL 2000 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ,，做 50 倍稀釋 ,，總共稀釋100000 倍,；

每步稀釋時取液量不少于 3μL ，稀釋倍數(shù)不超過 100 倍,。每步稀釋都需混合均勻 ,，避免起泡。

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,，然后1000×g離心20分鐘,，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。

3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞,，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融,。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清檢測。

4. 細胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。

5. 其它生物標本：1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測。

6. 樣品外觀：樣品應清澈透明,，懸浮物應離心去除,。

7. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝,，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測）,，或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復凍融,，標本溶血會影響最后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

檢測前準備工作：

1. 請提10分鐘從冰箱中取出試劑盒,，平衡至室溫,。

標準品梯度工作液配制：加入1mL通用稀釋液至凍干標準品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為800pg/mL),，然后按照以下濃度：800pg/mL、400pg/mL,、200pg/mL,、 100pg/mL、50pg/mL,、25pg/mL,、 12.5pg/mL、0pg/mL進行稀釋,。

倍比稀釋方法：取7支 EP管,，每管中加入500μL通用稀釋液,200pg/mL的標準品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成100pg/mL的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻,。最后一管直接作為空白孔,，不需要再從倒數(shù)第二管中吸取液體，具體如下圖,。

1. 生物素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將濃縮生物素化抗體于1000×g離心1分鐘,，以通用稀釋液將100×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當日使用,。

2. 酶結(jié)合物工作液配制：使用前15分鐘將100x濃縮酶結(jié)合物于1000×g離心1分鐘,，以通用稀釋液將100×濃縮HRP酶結(jié)合物稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當日使用,。

3. 1×洗滌液配制：取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,，屬于正常現(xiàn)象,，可放置室溫,，輕搖均勻，待結(jié)晶溶解后再配置),。

操作步驟：

1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl每孔加入相應孔中，空白孔加入100μL通用稀釋液,。蓋上封板膜后37℃溫育1小時,。（建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內(nèi)測試。從而減少基質(zhì)效應對測試結(jié)果的誤差影響,，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數(shù),。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔）。

3. 加生物素化抗體：取出酶標板,，棄去液體,，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液100μL,，蓋上封板膜后37℃溫育1小時,。

4. 洗板：棄去液體，每孔加入300μL 1x洗滌液,，靜置1分鐘,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復洗板3次（也可用洗板機洗板）,。

5. 加酶結(jié)合物工作液：每孔加入酶結(jié)合物工作液100μL，蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘,。

6. 洗板：棄去液體按步驟4洗滌方法,，洗板5次。

7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL,，蓋上封板膜,，37℃避光溫育15分鐘。

8.  加終止液：取出酶標板,，每孔直接加入終止液50μL,，立即在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷：

1. 計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值,。以濃度為橫坐標,，OD值為縱坐標，在雙對數(shù)坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值),。

2. 若樣品OD值高于標準曲線上限,，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考,，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標準曲線,。

試劑盒性能：

1. 重復性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%,。

2. 回收率：在選取的健康人血清,、血漿和組織勻漿中加入3個不同濃度水平的人PI,，計算回收率

3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人PI,，在標準曲線動力學范圍內(nèi)進行稀釋,，評估線性。評估線性,。