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人胎盤生長因子（PLGF）試劑盒（ELISA） 使用說明書
l 本試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中人胎盤生長因子（PLGF）的含量。
l 有效期：6個月
l 保存條件：2-8℃
l 本試劑盒僅供科研使用,，不得用于臨床診斷
實驗原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被人胎盤生長因子（PLGF）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本,、標準品,、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人胎盤生長因子（PLGF）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。
樣本處理及要求
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果）,，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中,，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復凍融,。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測,。
4. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
注：標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
需要而未提供的試劑和器材
1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
4. 蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無 |
標準品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 | 無 |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無 |
檢測抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無 |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無 |
底物B | 6mL | 3mL | 無 |
終止液 | 6mL | 3mL | 無 |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無 |
說明書 | 1份 | 1份 | 無 |
自封袋 | 1個 | 1個 | 無 |
備注：
1. 標準品濃度依次為：80,、40、20,、10,、5、2.5 pg/mL
2. 經(jīng)過大量正常標本檢驗,，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過最大標準品濃度時,，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗,。
注意事項
1. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。
2. 洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。
3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。
4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果,。
6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性,。
9. 不能使用過期產(chǎn)品,。
10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
試劑準備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2. 設(shè)置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3. 樣本孔中加入待測樣本50μL,；空白孔不加,。
4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）,。
6. 每孔加入底物A,、B各50μL，37℃避光孵育15min,。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。
實驗結(jié)果計算
以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標,，在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線,，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程,，計算出樣品的濃度,。
試劑盒性能
1. 檢測范圍：2.5 pg/mL – 80 pg/mL。
2. 靈敏度：檢測濃度小于0.1 pg/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應,。
重復性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,，板間變異系數(shù)小于15%
