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上海仁捷生物科技有限公司
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瘦素檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）操作說(shuō)明
瘦素檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：瘦素檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）
英文名稱：Leptin (Sandwich) ELISA
【產(chǎn)品規(guī)格】
96T
【預(yù)期用途】
試劑盒可用于人血清和血漿中瘦素的定量檢測(cè),。
【檢測(cè)原理】
DRG公司的瘦素酶免實(shí)驗(yàn)是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）,，微孔內(nèi)包被有能結(jié)合瘦素分子上*抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。含有內(nèi)源性瘦素的病人樣本在包被孔中與特異性兔抗瘦素抗體進(jìn)行溫育,，之后就會(huì)形成一個(gè)夾心復(fù)合物,。溫育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的物質(zhì),，再加入鏈霉親和素過(guò)氧化物酶復(fù)合物來(lái)檢測(cè)結(jié)合的瘦素,，加入底物溶液，顏色強(qiáng)度與病人樣品中瘦素的濃度成正比,。
【試劑盒組成成分】
微孔板 12×8
包被了抗瘦素單克隆抗體,。
標(biāo)準(zhǔn)品（0~5） 6×0.5ml
濃度0、2,、5,、25、50、100ng/ml 內(nèi)含無(wú)汞防腐劑,。
質(zhì)控品 2×0.5ml
即用型,、具體數(shù)值與范圍請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽或QC質(zhì)控單、內(nèi)含無(wú)汞防腐劑,。
分析緩沖液 1×11ml
即用型
抗血清 1×11ml
即用型,、生物素化抗瘦素單抗、內(nèi)含無(wú)汞防腐劑,。
酶聯(lián)物 1×11ml
即用型,、含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素、內(nèi)含無(wú)汞防腐劑,。
底物液 1×14ml
含TMB,、即用型。
終止液 1×14ml
即用型,、內(nèi)含0.5M的H2SO4,、避免接觸終止液、以免刺激皮膚或灼傷皮膚,。
洗滌液 1×30ml
40倍濃縮
注：根據(jù)需要可額外訂購(gòu)樣本稀釋用的零標(biāo)準(zhǔn)品,。
所需材料（未提供）
1) 酶標(biāo)儀 （450±10nm）
2) 精確取樣槍
3) 吸水紙
4) 蒸餾水
5) 計(jì)時(shí)器
6) 半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙或數(shù)據(jù)處理軟件
【儲(chǔ)存條件】
未開(kāi)封的試劑在2~8℃下可保存至有效期，不要使用過(guò)期的試劑,。
開(kāi)封的試劑和微孔板必須貯存于2~8℃,，密封袋一旦打開(kāi)后，應(yīng)立即密封好,。
【樣本要求】
此試驗(yàn)采用血清或血漿,。
不要使用溶血，脂血或黃疸血樣本,。
注意：含有疊氮化物的樣本不能使用,。
樣本采集
血清
靜脈采血采集全血，允許凝集,，室溫下離心分離出血清,；樣本未*凝集前不能離心；含有抗凝劑的樣本可能需要更長(zhǎng)的凝集時(shí)間,。
血漿
將全血采集至含有抗凝劑的離心管內(nèi),，離心分離。
樣本儲(chǔ)存
樣本采集后蓋好蓋子,，2~8℃下可保存24小時(shí),；若要保存更長(zhǎng)時(shí)間，則需凍存于-20℃,；解凍的樣本實(shí)驗(yàn)前來(lái)回倒置數(shù)次混勻,。
樣本稀釋
初次試驗(yàn)中,，若出現(xiàn)樣本的濃度值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則需將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋,，并重新檢測(cè),，最終結(jié)果應(yīng)乘以相關(guān)的稀釋因子。
例如：
A) 1:10稀釋 10ul的血清+90ul的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）
B）1:100稀釋 10ulA)1:10稀釋的+90ul的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）
【檢測(cè)方法】
實(shí)驗(yàn)前將所有試劑和試驗(yàn)所需板條平衡至室溫,。
標(biāo)準(zhǔn)品
加0.5ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品試劑瓶?jī)?nèi),，，靜置10分鐘,，使用前混勻,。
注意：配制的標(biāo)準(zhǔn)品在2~8℃下可保存6周，需保存更長(zhǎng)時(shí)間需在-20℃下凍存,。
質(zhì)控品
加0.5ml的去離子水至質(zhì)控品試劑瓶?jī)?nèi),，，靜置10分鐘,，使用前混勻,。
注意：配制的標(biāo)準(zhǔn)品在2~8℃下可保存6周,，需保存更長(zhǎng)時(shí)間需在-20℃下凍存,。
洗滌液
30ml的濃縮洗滌液+1170ml的去離子水混合，得到1200ml的即用型洗滌液,；稀釋的洗滌液可在室溫下保存2周,。
檢測(cè)步驟
每次實(shí)驗(yàn)都要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1) 將實(shí)驗(yàn)所需板條固定于板架上,。
2) 加15ul的標(biāo)準(zhǔn)品,，質(zhì)控品和樣本于相應(yīng)的孔內(nèi)。
3) 每孔加100ul的分析緩沖液,；充分混合10秒,，此步中*混合很重要。
4) 室溫下,，不蓋板,，溫育120min。
5) 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液,，每孔加300ul的洗滌液洗板3次,，吸水紙上拍干。
注意：試驗(yàn)靈敏度和精確度與洗板準(zhǔn)確與否相關(guān),。
6) 每孔加100ul的抗血清,。
7) 室溫下溫育30min。
8) 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液,，每孔加300ul的洗滌液洗板3次,，吸水紙上拍干。
9) 每孔加100ul的酶聯(lián)混合物。
10) 室溫下溫育30min,。
11) 棄去孔內(nèi)反應(yīng)液,，每孔加300ul的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干,。
12) 每孔加100ul的底物液,。
13) 室溫下溫育15min。
14) 每孔加50ul的終止液,。
15) 加入終止液10min內(nèi)在酶標(biāo)儀450±10nm處讀數(shù),。
【結(jié)果計(jì)算】
1) 計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品和樣本的OD均值,。
2) 在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上,，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD均值為Y軸，濃度為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。
3) 樣本的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取,。
4) 自動(dòng)計(jì)算方法：說(shuō)明書(shū)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)4參數(shù)邏輯函數(shù)法計(jì)算得到，4PL是最佳方法,，其他的方法可能會(huì)有些許的偏差,。
5) 樣本濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取,；若樣本濃度值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品,，則需進(jìn)一步稀釋重新檢測(cè)；最終結(jié)果計(jì)算時(shí)應(yīng)乘以相關(guān)的稀釋因子,。
典型標(biāo)準(zhǔn)曲線示例
以下數(shù)據(jù)僅供解釋說(shuō)明,，不能用作試驗(yàn)的計(jì)算。
標(biāo)準(zhǔn)品（ng/ml） | OD值（450nm） |
0 | 0.02 |
2 | 0.07 |
5 | 0.16 |
25 | 0.74 |
50 | 1.41 |
100 | 2.30 |
【注意事項(xiàng)】
1) 此試劑盒僅供科研使用,。
2) 試劑盒內(nèi)所有含人血清或血漿的試劑都已經(jīng)過(guò)FDA檢測(cè)HIV I/II, HBsAg 和HCV呈陰性,，但使用及處理時(shí)應(yīng)視其為潛在生化危害物質(zhì)對(duì)待。
3) 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,，認(rèn)真閱讀試劑盒內(nèi)配套的使用說(shuō)明書(shū),，確保*理解。
4) 微孔板可拆,，未使用的板條應(yīng)放回至密封袋內(nèi)貯存于2-8℃,。
5) 每次加樣要快，加樣順序應(yīng)一致,。
6) 一個(gè)試劑瓶只能用于裝一種試劑,，尤其是底物液試劑瓶；若用裝過(guò)了酶聯(lián)物的試劑瓶重新裝底物液的話則會(huì)發(fā)生的溶液顏色改變,，且不能將剩余溶液倒回至原試劑瓶,，以免污染試劑,。
7) 微孔板內(nèi)的試劑應(yīng)*混勻，確保得到好的結(jié)果,，不要重復(fù)使用微孔板,。
8) 試驗(yàn)中，不要使微孔出現(xiàn)干燥,，洗板后立即加入下一個(gè)試劑,。
9) 實(shí)驗(yàn)前將所有試劑平衡至室溫，溫度會(huì)影響吸收值的讀取,，但是樣本值不會(huì)受影響,。
10) 不要用嘴吸樣，避免接觸試劑和樣本,。
11) 實(shí)驗(yàn)區(qū)禁止抽煙,，飲食或化妝。
12) 處理樣本和試劑時(shí)佩戴一次性手套,，微生物污染的試劑或樣本會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果,。
13) 嚴(yán)格按照相關(guān)國(guó)家生物安全法規(guī)要求來(lái)處理。
14) 不要使用過(guò)期的試劑,。
15) 加樣量嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求來(lái),，使用校準(zhǔn)加樣器和酶標(biāo)儀則會(huì)得到最佳結(jié)果。
16) 不要混合使用不同批次的試劑,，也不能交換同一批次的板條,；運(yùn)輸或貯存環(huán)境不同和微孔板的結(jié)合特性會(huì)導(dǎo)致結(jié)果些許差異,。
17) 避免接觸終止液,，會(huì)腐蝕和燒傷皮膚。
18) 含有Proclin 300, BND 和 MIT作為防腐劑的試劑應(yīng)避免接觸,，若接觸到則立即用大量水進(jìn)行沖洗,。
19) TMB底物液具有刺激作用，若接觸到則立即用肥皂清洗和大量水沖洗,。
20) 化學(xué)物質(zhì)和配制的試劑應(yīng)根據(jù)國(guó)家生化危害安全規(guī)章要求處理,。
21) 試劑盒內(nèi)相關(guān)危害物質(zhì)信息詳見(jiàn)MSDS，可向DRG索取,。
【操作注意事項(xiàng)】
1) 實(shí)驗(yàn)前,，所有試劑和樣本都應(yīng)平衡至室溫，混合時(shí)避免出現(xiàn)氣泡,。
2) 實(shí)驗(yàn)一旦開(kāi)始,，必須無(wú)中斷的完成全部試驗(yàn)。
3) 避免交叉污染,，每次加樣時(shí)都使用新的槍頭,。
4) 吸收值與溫育時(shí)間和溫度有關(guān),，試驗(yàn)開(kāi)始前，將所有試劑準(zhǔn)備好,，打開(kāi)蓋子,，所需板條固定于板架上等，確保無(wú)間斷的,，時(shí)間間隔一致的加樣,。
5) 酶反應(yīng)一般規(guī)則，時(shí)間和溫度是一個(gè)線性相關(guān)關(guān)系,。
僅供科研使用
