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1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣,、組織,、飼料等樣本中的萊克多巴胺（Ractopamine，Rac）,，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板,、辣根酶標(biāo)記物、抗體,、標(biāo)準品及其他配套試劑組成,。檢測時，加入標(biāo)準品或樣品溶液,，樣本中的萊克多巴胺和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗萊克多巴胺抗體,，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含萊克多巴胺含量成負相關(guān),，與標(biāo)準曲線比較即可得出樣本中萊克多巴胺的殘留量,。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min,。

2.3 檢測下限：

尿液樣本………………………………0.1ppb

組織（處理方法一）…………………0.4ppb

肌肉樣本（處理方法二）……………0.1ppb

肝臟樣本（處理方法二）……………0.2ppb

飼料樣本………………………………1ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

萊克多巴胺 ………………………… 100%

多巴酚丁胺……………………………< 1%

克倫特羅………………………………<0.1%

沙丁胺醇………………………………<0.1%

2.5 樣本回收率：

尿樣………………………………………95%±10%

組織………………………………………90%±15%

飼料………………………………………90%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板…………………………………96孔

標(biāo)準液（綠蓋）：各1ml

0ppb,，0.1ppb，0.3ppb,，0.9 ppb,，2.7ppb，8.1ppb

高標(biāo)準液（紅蓋）：100ppb……………1ml

酶標(biāo)記物 (紅蓋)…………………………5.5ml

抗體工作液 (藍蓋)………………………9ml

底物液A (白蓋)…………………………6ml

底物液B(黑蓋)……………………………6ml

終止液(黃蓋)……………………………6ml

20X濃縮洗滌液(透明蓋)………………40 ml

10X復(fù)溶液(黃蓋)………………………50 ml

說明書………………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀,、打印機,、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置,、振蕩器,、離心機、刻度移液管,、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl,，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：正己烷,、乙腈,、甲醇、無水硫酸鈉

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

    實驗中必須使用一次性吸頭,，在吸取不同的試劑時要更換吸頭,。實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具,，以避免污染干擾實驗結(jié)果,。

5.2 配液：

配液1：復(fù)溶液

    用去離子水將10×復(fù)溶液按1:9 體積比進行稀釋，用于樣本的復(fù)溶,，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月,。

5.3 樣本前處理步驟：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果,。

5.3.1 尿樣處理方法：

    直接取20µl清亮尿樣進行測定（渾濁尿樣需要過濾或經(jīng)4000r/min離心5min,，以得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存,。

尿樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.1ppb

5.3.2 組織樣本處理方法一：

   稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ,，加入6ml復(fù)溶液，充分振蕩2min,，室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高,，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。取20µl上清液進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：0.4ppb

5.3.3 組織樣本（肌肉和肝臟）處理方法二：

1）稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g ,，加入8ml乙腈溶液,，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min,。

2）取上清液5ml,，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；

▲肌肉樣本：

    加入1ml 復(fù)溶液混合振蕩30s,，取20µl用于分析,。

肌肉樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.1ppb

▲肝臟樣本：

    加入2ml正己烷振蕩溶解,，再加入1ml 去離子水混合振蕩30s,，室溫4000r/min以上離心5min，去除上層,；取50µl下層與50µl復(fù)溶液混勻,；取20µl用于分析。

肝樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.2ppb

5.3.4 飼料樣本處理方法：

1）稱取均質(zhì)后的飼料樣品1.0±0.05g,，加入10ml甲醇,，再加入5g無水硫酸鈉，振蕩2min,；室溫 4000r/min以上離心10min,；

2）吸出離心后的上清液1ml，于56℃氮氣吹干,，用1 ml復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,，再加入1mL正己烷混合30s；室溫4000r/min以上離心5min,。

3）取20µl下層進行分析,。

樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：1ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,，每種液體試劑使用前均須搖勻,。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋,，保存于2-8℃,。

實驗開始前需：將20×濃縮洗滌液用去離子水按1:19稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標(biāo)準品做2孔平行,，并記錄標(biāo)準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準品或樣本20µl/孔到各自的微孔中,，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔,，再加入80µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻,，25℃反應(yīng)30分鐘,。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干,，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次,，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl,，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻,，25℃避光顯色15分鐘,。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻,，終止反應(yīng),。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)終止反應(yīng)后在10分鐘內(nèi)完成,。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以個標(biāo)準（0ppb）的吸光度值,，再乘以100%，即

A—標(biāo)準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準品百分吸光率為縱坐標(biāo),，對應(yīng)的標(biāo)準品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準品的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準曲線中,，從標(biāo)準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,，更便于大量樣本的準確,、快速分析。

8 注意事項

8.1 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準的OD值偏低,。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會出現(xiàn)標(biāo)準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作,。

8.3 混合要均勻，洗板要*,，在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中,，用蓋板膜封住微孔板,，避免光線照射,。

8.5 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度的降低,。不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑,。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之,。0標(biāo)準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時,，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液為稀硫酸,，避免接觸皮膚,。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍,。