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人醛糖還原酶（AR）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定人血清,、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中醛糖還原酶（AR）的含量,。
實驗原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人醛糖還原酶（AR）水平,。用純化的人醛糖還原酶（AR）捕獲抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入人醛糖還原酶（AR）,，再與HRP標記的檢測抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人醛糖還原酶（AR）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中人醛糖還原酶（AR）含量,。
試劑盒組成：
試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
說明書 | 1份 | 1份 |
|
封板膜 | 2片 | 2片 |
|
密封袋 | 1個 | 1個 |
|
酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
標準品 | 0.3ml×6管 | 0.3ml×6管 | 2-8℃保存 |
酶標試劑 | 5 ml×1瓶 | 10 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
20×濃縮洗滌液 | 15ml×1瓶 | 25ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
注：標準品濃度依次為：20、10,、5,、2.5、1.25,、0 ng/mL.
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。胸腹水,、腦脊液參照實行,。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用,。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
- 標準品的加樣：設(shè)置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；。
- 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）,、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。
- 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外,。
- 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘,。
- 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
- 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。
- 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
- 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。
- 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。
注意事項：
- 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
- 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果,。
- 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差,。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
- 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔,。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
- 封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。
- 底物請避光保存,。
- 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
- 所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
- 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,，以英文說明書為準,。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD
值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋
倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值
代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。
2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% ,。
檢測范圍：
0.625 ng/mL - 20 ng/mL
靈敏度：
zui低檢測濃度小于0.1 ng/mL
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存： 2-8℃,。
2．有效期： 6個月
