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 酶 切 反 應(yīng)
(Setting Up a Restriction Endonuclease Reaction)

一,、 建立一個標準的酶切反應(yīng)
　目前大多數(shù)研究者遵循一條規(guī)則，即10個單位的內(nèi)切酶可以切割1μg不同來源和純度的DNA,。通常,，一個50μl的反應(yīng)體系中,，1μl的酶在1X NEBuffer終濃度及相應(yīng)溫度條件下反應(yīng)1小時即可降解1μg已純化好的DNA。如果加入更多的酶,，則可相應(yīng)縮短反應(yīng)時間,；如果減少酶的用量,，對許多酶來說，相應(yīng)延長反應(yīng)時間（不超過16小時）也可*反應(yīng),。

二,、 選擇正確的酶
　不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個相應(yīng)的識別位點,。識別堿基數(shù)目少的酶比堿基數(shù)目多的酶更頻繁地切割底物,。假設(shè)一個GC含量50%的DNA鏈，一個識別4個堿基的酶將平均在每44（256）個堿基中切割一次,；而一個識別6個堿基的酶將平均在每46（4096）堿基切割一次,。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的（3''或5''突出端），也可以是平端的片段,。粘端產(chǎn)物可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接,，而所有的平端產(chǎn)物都可以互相連接。相關(guān)信息參見目錄的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文,。

三,、 酶
　內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當立即置于冰上。酶應(yīng)當是*后一個被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當已經(jīng)加好并已預(yù)混合）,。酶的用量視在底物上的切割頻率而定,。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超過1U/μg的酶才能被*切割,。參見目錄第244和264之"切割質(zhì)粒DNA"和"包埋法切割DNA"。

四,、 DNA
　待切割的DNA應(yīng)當已去除酚,、乙醇、EDTA,、去污劑或過多鹽離子的污染,，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素,。關(guān)于甲基化的內(nèi)容,，參見第252頁至253頁之甲基化相關(guān)內(nèi)容。

五,、 緩沖液
　對于每一種酶NEB都提供相應(yīng)的*佳緩沖液,，可保證幾乎100%的酶活性。使用時的緩沖液濃度應(yīng)為1X,。有的酶要求100μg/ml的BSA以實現(xiàn)*佳活性,。在這種情況下，我們也相應(yīng)提供100X的BSA（10mg/ml）,。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響,。關(guān)于緩沖液更詳細的信息參見第234頁,。

六、 反應(yīng)體積
　內(nèi)切酶活力單位的定義是：1小時內(nèi),，50μl反應(yīng)體積中,，降解1μg的底物DNA所需的酶為一個活力單位。因此酶：DNA的反應(yīng)比例可以由此確定,。較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響,。為了將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過總體積的10%（一般酶都貯存于50%的甘油中）,。

七,、 混合
　這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應(yīng)*,，必須使反應(yīng)液充分混合,。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合,，然后再快速離心一下即可,。注意：不可振蕩！

八,、 反應(yīng)溫度
　大部分酶的反應(yīng)溫度為37°C,；從嗜熱菌中分離出來的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。一般為50-65°C不等,。參看第244頁 Activity of thermophiles at 37°C,。

九、 反應(yīng)時間
　1酶活單位的定義時間為1小時,。如果加入的酶較多,，可以相應(yīng)地縮短反應(yīng)時間；反之,，如果加入的酶量較少,，也可以延長時間以使反應(yīng)達到*。參見第241頁酶在反應(yīng)中的存活時間,。

十,、 終止反應(yīng)
　如果不進行下一步酶切反應(yīng)，可用終止液來終止反應(yīng),。在NEB我們使用如下反應(yīng)終止液：50%的甘油,，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚藍（10μl/50μl反應(yīng)液）,。如果要進行下一步酶切反應(yīng),，可用熱失活法終止反應(yīng)（65°C或85°C，20分鐘）。熱失活并不能適用于所有的酶,，詳情參見第240頁熱失活表,。此外，酚抽提也可以用于終止反應(yīng),。

十一,、貯存
　大部分酶應(yīng)貯存于-20°C。少部分酶則須在-70°C長期保存,。詳情請參見相關(guān)酶的DATA SHEET 或目錄相關(guān)部分,。10X BUFFER 和100X BSA于-20°C保存。BSA不能與NEBuffer混合后保存,，否則將會出現(xiàn)BSA沉淀,。

十二、穩(wěn)定性
　每隔1-2個月都會對所有的酶有一個活性檢測,；*近的一次檢測結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上,。通過三十多年來的經(jīng)驗，我們發(fā)現(xiàn)大部分酶在推薦的保存緩沖液里在-20°C條件下十分穩(wěn)定,。高于-20°C條件下穩(wěn)定性將有所降低,。

十三、對照反應(yīng)
　如果發(fā)現(xiàn)您的DNA底物不能被成功切開,，可以進行對照實驗以查明原因,。具體方法如下：
　將不加內(nèi)切酶的底物DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對照DNA（有多個已知酶切位點）同時進行反應(yīng)。若實驗結(jié)果表明底物DNA降解,，則說明DNA在純化過程中或反應(yīng)液里引入了核酸酶污染,；若實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對照DNA被成功切開,，則可以排除酶質(zhì)量的原因,，此時可以將對照DNA和待切底物DNA混合起來再次進行反應(yīng)，以確定樣品中是否有抑制劑,。如果有抑制劑存在（通常是鹽,、EDTA或酚）,，則混合物里的對照DNA也無法被切開,。