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你知道人腸脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP)ELISA試劑盒的操作原理嗎？

本試劑盒僅供研究使用。

檢測范圍：96T

0.5ng/mL-12ng/mL

使用目的：

本試劑盒用于測定人血清,、血漿及相關(guān)液體樣本中腸脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP)含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人腸脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP)水平,。用純化的人

腸脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP)抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入

腸脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP)，再與HRP標(biāo)記的腸脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP)抗體結(jié)合,，形成

抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下

轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的腸脂肪酸結(jié)合蛋白

（iFABP)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣

品中人腸肪酸結(jié)合蛋白（iFABP)濃度,。

試劑盒組成

130倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶

2酶標(biāo)試劑6ml×1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（24ng/mL）0.5ml×1瓶

3酶標(biāo)包被板12孔×8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶

4樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份

5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張

6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個

標(biāo)本要求

1．標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗,。若不能

馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

人腸脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP)ELISA試劑盒操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀

釋,。

12ng/mL5號標(biāo)準(zhǔn)品150µl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

6ng/mL4號標(biāo)準(zhǔn)品150µl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

3ng/mL3號標(biāo)準(zhǔn)品150µl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

1.5ng/mL2號標(biāo)準(zhǔn)品150µl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0.75ng/mL1號標(biāo)準(zhǔn)品150µl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、

待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50µl,，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl,，

然后再加待測樣品10µl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡

量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此

重復(fù)5次,，拍干,。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50µl，空白孔除外。

7.溫育：操作同3,。

8.洗滌：操作同5,。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色

15分鐘.

10.終止：每孔加終止液50µl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。

11.測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止

液后15分鐘以內(nèi)進行,。

操作程序總結(jié)：

計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的

OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)

準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，

即為樣品的實際濃度,。

人腸脂肪酸結(jié)合蛋白（iFABP)ELISA試劑盒注意事項

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未

用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果,。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,，以避免試驗誤差,。一次加樣時間

控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4．請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值

大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計

算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。

6．底物請避光保存。

7．嚴(yán)格按照說明書的操作進行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．本試劑不同批號組分不得混用,。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：；2-8℃,。

2．有效期：6個月