PCR是一種選擇性體外快速擴增DNA片段的方法。在體外以類似于細胞內(nèi)DNA的半保留復(fù)制過程,，以擬擴增的模板DNA分子，與模板DNA互補的寡核苷酸引物,、DNA聚合酶,、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應(yīng)體系，經(jīng)過重復(fù)地變性一退火一延伸三步,，擴增新的目的DNA鏈,，這個過程通過控制反應(yīng)體系的溫度來實現(xiàn)。那么你知道PCR反應(yīng)體系包括什么嗎,？讓我們一起來看看吧,！
 

　　一、模板(template)
 

　　模板即擴增用的DNA,，可以是任何來源DNA(如基因組DNA,、質(zhì)粒DNA等)或RNA(如總RNA、mRNA,、tRNA,、rRNA、病毒RNA等),，但必須符合兩個條件：一是純度必須較高,，二是濃度不能太高以免抑制。模板是待擴增的目的基因或特異片段,，如診斷病人是否攜帶有突變基因時,，其模板就是提取的病人血液中的DNA或RNA片段。PCR對模板DNA的純度不要求很高,，但應(yīng)盡量不含有對PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在,，如蛋白酶、核酸酶,、Taq DNA聚合酶抑制劑,、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。
 

　　二,、引物(primers)
 

　　人工合成的一對引物可以分別與兩條模板DNA互補結(jié)合的寡核苷酸序列,，其中一條稱為上游引物，另一條稱為下游引物,。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列,，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。引物濃度一般為0.1~0.5umol/L,，濃度過高會引起錯配和非特異擴增,，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般為15~30bp,引物過長或過短都會降低特異性,。其3'末端一定要與模板DNA配對,，末位堿基最好選用A、C,、G(因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸),。引物GC占45%~55%，堿基應(yīng)盡量隨機分布,，避免嘧啶或嘌呤堆積,，兩引物之間不應(yīng)有互補鏈存在，不能與非目的擴增區(qū)有同源性,。
 

　　三,、底物(dNTP)
 

　　dNTP包括dATP、dTTP,、dGTP,、dCTP。dNTP溶液呈酸性,，使用時應(yīng)配成高濃度后,，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)至7.0~7.5，小量分裝,，-20℃冰凍保存,。一般存儲濃度為10mo/L，各成分以等當(dāng)量配制,，反應(yīng)終濃度為20~200umol/L,，如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配,。高濃度可加速反應(yīng),，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性,，而反應(yīng)速度會降低,。
 

　　四、PCR緩沖液(PCR buffer)
 

　　緩沖液的成分最為復(fù)雜,，除水外一般包括四種有效成分：①緩沖體系,，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系,；②一價陽離子，一般采用鉀離子,，但在特殊情況下也可使用銨根離子,；③二價陽離子，即鎂離子,，根據(jù)反應(yīng)體系確定,，除特殊情況外不需調(diào)整；④輔助成分,，常見的有DMSO,、甘油等,，主要用來保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結(jié)構(gòu),。
 

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