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PCR反應體系包括什么

時間:2024-6-6 閱讀:1735
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  PCR是一種選擇性體外快速擴增DNA片段的方法,。在體外以類似于細胞內(nèi)DNA的半保留復制過程,以擬擴增的模板DNA分子,,與模板DNA互補的寡核苷酸引物,、DNA聚合酶、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應體系,,經(jīng)過重復地變性一退火一延伸三步,,擴增新的目的DNA鏈,這個過程通過控制反應體系的溫度來實現(xiàn),。那么你知道PCR反應體系包括什么嗎,?讓我們一起來看看吧!
 
  一,、模板(template)
 
  模板即擴增用的DNA,,可以是任何來源DNA(如基因組DNA、質(zhì)粒DNA等)或RNA(如總RNA,、mRNA、tRNA,、rRNA,、病毒RNA等),但必須符合兩個條件:一是純度必須較高,,二是濃度不能太高以免抑制,。模板是待擴增的目的基因或特異片段,如診斷病人是否攜帶有突變基因時,,其模板就是提取的病人血液中的DNA或RNA片段,。PCR對模板DNA的純度不要求很高,但應盡量不含有對PCR反應有抑制作用的雜質(zhì)存在,如蛋白酶,、核酸酶,、Taq DNA聚合酶抑制劑、能與DNA結合的蛋白質(zhì),。
 
  二,、引物(primers)
 
  人工合成的一對引物可以分別與兩條模板DNA互補結合的寡核苷酸序列,其中一條稱為上游引物,,另一條稱為下游引物,。引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度,。理論上,,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增,。引物濃度一般為0.1~0.5umol/L,濃度過高會引起錯配和非特異擴增,,濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低,。引物長度一般為15~30bp,引物過長或過短都會降低特異性。其3'末端一定要與模板DNA配對,,末位堿基最好選用A,、C、G(因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸),。引物GC占45%~55%,,堿基應盡量隨機分布,避免嘧啶或嘌呤堆積,,兩引物之間不應有互補鏈存在,,不能與非目的擴增區(qū)有同源性。
 
  三,、底物(dNTP)
 
  dNTP包括dATP,、dTTP、dGTP,、dCTP,。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,,以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)至7.0~7.5,,小量分裝,-20℃冰凍保存,。一般存儲濃度為10mo/L,,各成分以等當量配制,,反應終濃度為20~200umol/L,如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(偏高或偏低),,就會引起錯配,。高濃度可加速反應,但同時增加錯誤摻入和實驗成本,;低濃度可提高精確性,,而反應速度會降低。
 
  四,、PCR緩沖液(PCR buffer)
 
  緩沖液的成分最為復雜,,除水外一般包括四種有效成分:①緩沖體系,一般使用HEPES或MOPS緩沖體系,;②一價陽離子,,一般采用鉀離子,但在特殊情況下也可使用銨根離子,;③二價陽離子,,即鎂離子,根據(jù)反應體系確定,,除特殊情況外不需調(diào)整,;④輔助成分,常見的有DMSO,、甘油等,,主要用來保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結構。
 
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