EZBioscience^® 2× Color SYBR Green qPCR 預(yù)混液 （ROX2 plus） 使用經(jīng)過特殊修飾的 Taq DNA 聚合酶,，該聚合酶受熱啟動(dòng)保護(hù)活化技術(shù)和優(yōu)化的qPCR緩沖液系統(tǒng)，以進(jìn)行基于SYBR Green I的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）,。該混合物補(bǔ)充了惰性紅色染料,。以及 EZBioscience^® 彩色逆轉(zhuǎn)錄試劑盒含有惰性藍(lán)色染料,，以避免移液錯(cuò)誤。在qPCR反應(yīng)中將cDNA和其他組分混合在一起,，使溶液變成紫色,。這在移液時(shí)提供了視覺幫助，并降低了反應(yīng)設(shè)置過程中移液錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn),，尤其是在使用白色反應(yīng)容器時(shí),。染料不影響qPCR反應(yīng)的特異性或靈敏度。該混合物以 2× 的反應(yīng)濃度制備,，可直接用于高模板和低模板 qPCR,，具有高靈敏度、特異性和可靠性,。

常見問題及解決方法：

1. 陰性對(duì)照組可觀察到明顯擴(kuò)增

原因：使用的試劑或水被污染,、引物二聚體的外觀

解決方法：更換新試劑或水并重試。反應(yīng)應(yīng)在超凈臺(tái)架上進(jìn)行,，以盡量減少空氣污染,、在35個(gè)周期后,，陰性E對(duì)照組出現(xiàn)擴(kuò)增是正常的可以結(jié)合熔融曲線進(jìn)行分析

2. ct值出現(xiàn)太晚(大)

原因：放大效率低,、模板的濃度太低、模板退化,、擴(kuò)增子太長(zhǎng),、反應(yīng)中存在PCR抑制劑

解決方法：優(yōu)化反應(yīng),，嘗試三步程序或重新設(shè)計(jì)引物、增加模板量,，同時(shí)避免破壞擴(kuò)增效果、準(zhǔn)備新的模板,，然后重試,、擴(kuò)增子的長(zhǎng)度建議在100bp~200 bp之間,、添加模板時(shí)通常會(huì)引入抑制劑,，增加稀釋倍數(shù)或準(zhǔn)備新模板并重試,。

3. 擴(kuò)增曲線形狀異常

原因：擴(kuò)增曲線粗略,、曲線斷裂、曲線突然下降

解決方法：信號(hào)弱而引起的系統(tǒng)整流,，升高模板濃度并重復(fù)反應(yīng),、模板的濃度太高,，基線的結(jié)束值大于Ct值，減少基線的末端(Ct值-4),，并重新分析數(shù)據(jù),、反應(yīng)管中存在氣泡,，當(dāng)溫度升高時(shí)，氣泡破裂,，從而儀器檢測(cè)到熒光值的突然降低,，快速旋轉(zhuǎn)，仔細(xì)檢查反應(yīng)前是否有氣泡,。

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