細(xì)胞的來(lái)源多樣，培養(yǎng)方法也各不相同，凡是來(lái)源于胚胎,、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞,。原代細(xì)胞經(jīng)分散接種之手段稱為傳代,。凡能經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。若能穩(wěn)定生長(zhǎng)傳10~20代以上的細(xì)胞可確立為細(xì)胞系,。若有條件能開(kāi)展單細(xì)胞克隆,、純化，經(jīng)大量擴(kuò)增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細(xì)胞群,，稱之為細(xì)胞株或克隆細(xì)胞,。此過(guò)程稱為細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ),，只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習(xí)和掌握其他方法,本章重點(diǎn)敘述常用的基本技術(shù),。   

*節(jié) 原代細(xì)胞的取材   

人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的要條件，是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的*步,，若取材不當(dāng),，將會(huì)直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)，現(xiàn)將取材的基本要求和注意事項(xiàng)敘述如下：   

一,、取材的基本要求   

（1）取材要注意新鮮和保鮮 新鮮組織易于培養(yǎng)成功,，取材時(shí)應(yīng)盡量在4~6h內(nèi)能制作成細(xì)胞，盡快入箱培養(yǎng),，若不能即時(shí)培養(yǎng),，應(yīng)將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，于4℃存放。若組織塊較大,，應(yīng)在清除表面壞死組織,、脂肪和結(jié)締組織后，切碎于培養(yǎng)液內(nèi)4℃存放,，但時(shí)間不能超過(guò)24h,。對(duì)于已切碎的組織或血液、淋巴組織應(yīng)加入含10%二甲基亞砜的培養(yǎng)基,，按細(xì)胞凍存方式于液氮中冷凍保存,。   

（2）取材應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌 所取標(biāo)本材料應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，為了確保無(wú)菌,，對(duì)所取材料若疑有污染的可能,，應(yīng)將所取組織在含高濃度抗菌素（400單位/mL）甚加入適量的兩性霉素B或10%達(dá)克寧液的培養(yǎng)液內(nèi)于4℃下存放2小時(shí)以上，再用PBS洗2~3次,，以確保所取材料無(wú)菌,。要用無(wú)菌包裝的器皿或事先消毒好的帶少許培養(yǎng)液（內(nèi)含400單位/mL抗菌素）的小瓶等便于攜帶的物品來(lái)取材，所取材料應(yīng)避免接觸有毒有害的化學(xué)物質(zhì),，如碘,、汞等。   

（3）取材和原代細(xì)胞制作時(shí),，要用鋒利的器械,，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷,。   

（4）要仔細(xì)去除所取材料上的血液,、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織,，切碎組織時(shí)應(yīng)避免組織干燥,，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。   

（5）取材應(yīng)注意組織類型,、分化程度、年齡等,，一般來(lái)講,，胚胎組織較成熟個(gè)體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長(zhǎng),，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng),。取材時(shí)應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。   

（6）原代細(xì)胞取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本,。對(duì)組織的來(lái)源,、部位、包括供體的一般情況要做詳細(xì)的記錄，以備以后查詢,。   

二,、各類組織的取材技術(shù)   

(一) 皮膚和粘膜的取材   

皮膚和粘膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要組織來(lái)源，主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片,，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作,，但面積一般2~4cm2即可，這樣局部*痕,，若對(duì)燒傷皮膚進(jìn)行上皮細(xì)胞膜片移植,，可從大腿或臀部取較大皮片，可取2~4cm2皮片,，但取材時(shí)不要用碘酒消毒,；若培養(yǎng)上皮細(xì)胞，取材時(shí)不要切取太厚,，盡可能去除所攜帶的皮下或粘膜下組織,；若欲培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，則反之,。皮膚粘膜與外界相通部位,，因表面細(xì)菌、霉菌很多,，取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格消毒,，必要時(shí)要用高濃度抗菌素和適量?jī)尚悦顾谺漂洗、浸泡,。   

(二)內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材   

內(nèi)臟除消化道外基本是無(wú)菌的,，但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域,，要避開(kāi)破潰,、壞死液化部分，以防污染,，盡量去除混雜的結(jié)締組織,，否則培養(yǎng)后，由于成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)給以后的培養(yǎng)工作增加困難,。對(duì)于一些特殊細(xì)胞培養(yǎng)的取材,，詳見(jiàn)后面有關(guān)章節(jié)。   

(三)血液細(xì)胞的取材   

血液及淋巴組織中的血細(xì)胞,、淋巴細(xì)胞的取材,，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾,、扁桃體,、胸腺、淋巴結(jié)等）分離細(xì)胞，取材時(shí)應(yīng)注意抗凝,，通常采用肝素抗凝,，常用肝素濃度為8~10u/mL血，抽血的針筒也要用肝素濕潤(rùn),，若從血站取來(lái)的獻(xiàn)血員的血液,，因血站不用肝素抗凝劑，常用含枸椽酸鹽抗凝,，對(duì)此類血標(biāo)本千萬(wàn)不能用含鈣,、鎂離子的洗液來(lái)處理細(xì)胞，因此時(shí)的鈣,、鎂離子可加速血液中凝血酶促進(jìn)血液凝固而影響收獲血細(xì)胞及淋巴細(xì)胞,。此外要嚴(yán)格無(wú)菌，盡量新鮮使用,。   

(四)骨髓,、羊水、胸/腹水細(xì)胞取材   

取上述標(biāo)本時(shí),，除嚴(yán)格無(wú)菌,，注意抗凝外，還要盡快分離培養(yǎng),，一般無(wú)需其他處理,，離心后，用無(wú)鈣,、鎂PBS洗兩次,，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放,。具體操作詳見(jiàn)后面有關(guān)章節(jié),。   

(五)動(dòng)物組織取材   

1、鼠胚組織取材   

先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物,，然后將其整個(gè)浸泡在含有75%酒精的燒杯中,，5分鐘后（注意時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi),，影響組織活力）,，取出動(dòng)物，在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢,，切開(kāi)皮膚，用無(wú)菌操作法解剖取胚或用無(wú)菌止血鉗挾起皮膚,、用無(wú)菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開(kāi)皮膚,，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干,，然后再固定,，更換無(wú)菌解剖器材，采用無(wú)菌操作法解剖取出胚胎,。   

2,、幼鼠胚腎（或肺）取材   

幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上,，先切開(kāi)游離毛皮并拉開(kāi)兩側(cè)：然后采用無(wú)菌法打開(kāi)胸腔取肺,，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開(kāi)游離并拉向兩側(cè),，然后采用無(wú)菌法從背部打開(kāi)腹腔取腎,。   

(六)人胚體組織取材   

在局部先用碘酒后用75%酒精棉球消毒，無(wú)菌法取人胚肺（腎）,，方法與鼠類相同,。   

(七)雞（鴨）鳥(niǎo)類胚胎組織取材   

取孵化適當(dāng)胚齡（9~12天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢,，若有豐富血管,、胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋，說(shuō)明胚體發(fā)育良好,，并用有色筆劃出氣室和胚體位置,。將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼,，再用75%酒精棉球擦干,，經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后,，在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或中號(hào)鑷子打開(kāi)氣室,，沿氣室邊緣去除蛋殼，再用眼科鑷撕去殼膜,，暴露出雞胚,，再用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎,，放入無(wú)菌平皿中,，解剖取材。   

第二節(jié) 原代細(xì)胞的分離和制作   

人或動(dòng)物體內(nèi)（或胚胎組織）由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密,，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖,，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長(zhǎng),，若需獲取大量細(xì)胞,，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開(kāi),，使細(xì)胞解離出來(lái)，常采用的方法如下：   

一,、懸浮細(xì)胞的分離方法   

組織材料若來(lái)自血液,、羊水、胸水或腹水的懸液材料,，zui簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘,，若懸液量大，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間,，但速度不能太高,，延時(shí)也不能太長(zhǎng)，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞,，離心沉淀用無(wú)鈣,、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后,，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng),，若選用懸液中某些細(xì)胞，常采用離心后的細(xì)胞分層液,，因?yàn)?，?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞,。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見(jiàn)淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)的章節(jié),。   

二、實(shí)體組織材料的分離方法    

對(duì)于實(shí)體組織材料,，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密,，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液,，可采用機(jī)械分散法（物理裂解）和消化分離法,。   

（一）機(jī)械分散法   

所取材料若纖維成分很少，如腦組織,，部分胚胎組織可采用剪刀剪切,、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)（用九號(hào)針），使細(xì)胞通過(guò)針頭壓出,，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出,。此法分離細(xì)胞雖然簡(jiǎn)便、快速,，但對(duì)組織機(jī)械損傷大,，而且細(xì)胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織,。   

（二）消化分離法   

組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊（或糊狀）,，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng),，使團(tuán)塊膨松,，由塊狀變成絮狀,，此時(shí)再采用機(jī)械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散,，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種培養(yǎng)后,，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng),。   

1、酶消化分離法   
        酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶,，其分離方法如下：   

（1） 胰蛋白酶分散技術(shù)    

胰蛋白酶（簡(jiǎn)稱胰酶）是廣泛應(yīng)用的消化劑,。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用,，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開(kāi)，在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同,，對(duì)細(xì)胞的消化能力也不同,，胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的作用，取決于細(xì)胞類型,、酶的活力,、配制的濃度、消化的溫度,、無(wú)機(jī)鹽離子,、pH以及消化時(shí)間的長(zhǎng)短等。   

①細(xì)胞類型 胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝,、腎,、甲狀腺、羊膜,、胚胎組織,、上皮組織等。而對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織,如 乳腺,、滑膜,、子宮、纖維肉瘤,、腫瘤組織等就無(wú)效,，但若與膠原酶合用,就能增加其對(duì)組織的分離作用。   

②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過(guò)測(cè)定而有效,，但配制時(shí)必須新鮮,，需保存在低溫冰箱中,，消化時(shí)的pH和溫度都要適宜，否則會(huì)影響活力,，細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān),，zui終使用活力為1:200或1:250，56℃pH8.0時(shí)活力zui強(qiáng),。   

該酶為粉劑,，保藏時(shí)要防潮，室內(nèi)溫度不宜過(guò)高,，保存時(shí)間不能太長(zhǎng),，若粉劑結(jié)團(tuán)塊,說(shuō)明該部分受潮或失效。   

③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時(shí),，濃度可適當(dāng)提高,，消化時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。濃度高對(duì)細(xì)胞有毒性,，而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖,，若培養(yǎng)液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除,。   

④溫度 一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時(shí)活性zui強(qiáng),，但由于對(duì)細(xì)胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃,，通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快,。   

⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少,，活性強(qiáng)分散快,，細(xì)胞也容易被消化下來(lái)，消化分離細(xì)胞時(shí)PH只能選用7.6～8.0之間,，否則對(duì)細(xì)胞有損傷,。   

⑥無(wú)機(jī)鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來(lái)配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用,。因此,在配制時(shí)應(yīng)采用無(wú)鈣鎂離子的PBS配制,。   

⑦消化時(shí)間 如果細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以損害細(xì)胞的呼吸酶,，從而影響細(xì)胞的代謝,，一般消化時(shí)間為20分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液,，于4℃過(guò)夜也可,。   

分離方法如下：   

①過(guò)夜冷消化 將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右,，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織,，再加入0.25%的胰蛋白酶,，搖勻后放4℃過(guò)夜，次日再用Hanks液洗滌,，棄去上清,，共洗2~3次，然后,，加入少量營(yíng)養(yǎng)液吹打分散,，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng),。   

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：   

熱消化多次提取——將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液,，按合適的濃度分瓶培養(yǎng),，然后將留下的未*消化的組織按上述方法操作，再消化提取細(xì)胞,。   

冷消化多次提取——方法同上,，只是消化溫度為4℃。   

先熱消化后冷消化——將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散,，制成懸液,，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下過(guò)夜，次日再提取細(xì)胞,，分散成懸液,，分瓶培養(yǎng)。   

（2） 膠原酶（Collagenase）消化法    

膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶,，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用,。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用,，對(duì)細(xì)胞本身影響不大，可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害,。該酶分離效果好,，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,，即操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率，zui終濃度200u/mL或0.1～0.3mg/mL,。此酶消化作用緩和,，無(wú)需機(jī)械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高,，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本,。   

經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織,，由于上皮細(xì)胞對(duì)酶有耐受性，可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被*消化開(kāi),。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng),，因此不必要再進(jìn)一步消化處理。   
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性（見(jiàn)表4-1）和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)間（小時(shí)）有差異（見(jiàn)表4-2）,，以及兩者價(jià)格不等,，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時(shí)還可加透明質(zhì)酸酶（對(duì)細(xì)胞表面糖基有作用）,，采用兩者的聯(lián)合消化作用,，對(duì)分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效,。   

表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別   

項(xiàng) 目                               胰蛋白酶                          膠原酶   
消化特性                         適用于消化軟組織              適用于消化纖維多的組織   
用 量                             0.01%～0.5%                  0.1～0.3mg/mL(200u/mL)   
消化時(shí)間                            0.5～2小時(shí)（小塊）               1～12小時(shí)   
pH                                    8～9                            6.5～7.0   
作用強(qiáng)度                               強(qiáng)烈                                緩和   
細(xì)胞影響                          時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有影響                     無(wú)大影響   
血清,、鈣、鎂離子                     有影響                           無(wú)影響   

表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.5～1cm3) 

酶 種 類                           較 硬 組 織                       軟 組 織   
                                  4℃ 室 溫 37℃                   4℃ 室 溫 37℃   
胰蛋白酶(0.25%)                  24～48 1～6 1～2                 12～24 1～2 0.5～1   
膠原酶(200u/mL)                   24   6   6.5                     12   3   0.25   
兩者聯(lián)合                 12～46 12～24 4～12                12～24 6～12 1～2   

除上述兩種zui常用的消化酶外,，還有鏈霉蛋白酶,、粘蛋白酶、蝸牛酶,、彈性蛋白酶,、木瓜蛋白酶，近年來(lái),，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳,。   

2、非酶消化法（EDTA消化法）   

EDTA是一種非酶消化物,，又稱螯合劑或Versene,，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣,、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液,，對(duì)一些組織，尤其是上皮組織分散效果好,，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣,、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離,，缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀,，有團(tuán)塊，常不單獨(dú)使用,，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1）,，不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。   

消化分離法的操作步驟：   

（1）剪切 把組織塊剪碎,，呈1~5mm3大小的組織塊,。   

（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無(wú)鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）,。   

（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間（中間可輕搖1~2次）,，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液,，繼續(xù)消化直膨松絮狀為止,。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。   

（4）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液,。   

（5）漂洗 將含有鈣,、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng),，采用漂洗法洗2-3次后,，加入*培養(yǎng)基。   

（6）機(jī)械分散 采用吸管吹打或振蕩法,，使細(xì)胞充分散開(kāi)后用紗網(wǎng)或3~4層無(wú)菌紗布過(guò)濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘,，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng),。   

注意事項(xiàng)如下：   

（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用,。   

（2）胰蛋白濃度不宜過(guò)高,，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用,。   

（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液,，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕,，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失,。    

三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法   

原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng) 是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的培養(yǎng),，是建立細(xì)胞系的*步,，是一項(xiàng)基本技術(shù)。原代細(xì)胞因剛從組織中分離開(kāi),，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化,，仍保留原來(lái)的遺傳特性，也zui接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性,，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn),、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。   

原代細(xì)胞往往有多種細(xì)胞組成，比較混雜,，即使從形態(tài)上為同一類型（上皮樣或成纖維樣）,，但細(xì)胞間仍有很大差異。如果供體不同,，即使組織類型,、部位相同，個(gè)體差異也照樣存在,，原代細(xì)胞生物特性尚不穩(wěn)定,，如需做較為嚴(yán)格的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)研究，還需進(jìn)行短期傳代培養(yǎng),。   

1,、組織塊培養(yǎng)法   

組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法,，也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法,，故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法：為將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中,，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層,，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng),，方法簡(jiǎn)便,，利于培養(yǎng)，部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁24小時(shí)后細(xì)胞就從組織塊四周游出,，然后逐漸延伸,，長(zhǎng)成肉眼可以觀察到的生長(zhǎng)暈，5~7天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮,，此漂浮小塊可隨換液而棄去,，由組織塊周圍延伸的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實(shí)驗(yàn)研究,。  

其培養(yǎng)方法如下：   

(1)按照前述方法取材,，將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤(rùn),。   

(2)將小塊均勻涂布于瓶壁,，每小塊間距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培養(yǎng)瓶(底面積為17.5cm2)可接種20～30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶?jī)?nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶?jī)A斜放置在37℃溫箱內(nèi),。   

(3)培養(yǎng)2~4小時(shí),，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放,，靜置培養(yǎng),，動(dòng)作要輕,，嚴(yán)禁搖動(dòng)和來(lái)回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗,，若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清,、胎汁或鼠尾膠原等。開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多,，以保持組織塊濕潤(rùn)即可,，培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放,，開(kāi)始幾天盡量不去搬動(dòng),，以利貼壁和生長(zhǎng)，培養(yǎng)3~5天時(shí)可換液,，一方面補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng),，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。   
原代細(xì)胞培養(yǎng)－2   

2.消化培養(yǎng)法   

該方法是采用前述的消化分散法,，將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)（包括基質(zhì),、纖維等）去除，使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液,，然后分瓶培養(yǎng),。   

某些特殊類型細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞,、骨細(xì)胞等的消化手段和步驟,，將在有關(guān)章節(jié)中敘述。   

3.懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法   

對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞,，如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞,、骨髓細(xì)胞,、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離,，直接培養(yǎng),，或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。   

4.器官培養(yǎng)   

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后,，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng),，其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和、并能存活,，器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同,，但可利用器官培養(yǎng)對(duì)器官組織的生長(zhǎng)變化進(jìn)行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對(duì)器官組織的影響,。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性,，可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用,。
1. 器官培養(yǎng)的特殊的要求   

(1)需要特殊的培養(yǎng)條件 因器官離體培養(yǎng),，其營(yíng)養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來(lái)供給，因此,，培養(yǎng)時(shí)為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營(yíng)養(yǎng)而造成壞死,，其厚度或直徑不宜超過(guò)1mm。   

(2)器官內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法：   

a. 將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換,。   

b. 提高培養(yǎng)基中的氧分壓,，一般需加注純氧，提高氧分壓時(shí)仍需保持5% CO2,，以維持pH,。   

2. 器官培養(yǎng)的方法   

(1)將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養(yǎng)皿中,，高度為1/2皿高,，使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。   

(2)將培養(yǎng)基加入平皿中,，使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜,，但不要使濾膜浮起。   

(3)將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上,，一般厚度不要超過(guò)200μm,，水平面積不超過(guò)10mm2，如為肝,、腎不能大于1mm2,。   

(4)將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，并加注氧氣,，調(diào)整氧分壓達(dá)90%,，培養(yǎng)時(shí)注意使液面與膜保持在一致的水平上。   

(5)上述器官培養(yǎng)1~3周（每隔2~3天換液一次）后可用于實(shí)驗(yàn)和檢測(cè),。     

第三節(jié) 原代和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持   

一,、原代細(xì)胞的培養(yǎng)與維持   

(一)原代細(xì)胞培養(yǎng)   

1、靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))   

凡經(jīng)消化液處理實(shí)體組織來(lái)源的細(xì)胞要通過(guò)充分漂洗,，以盡量除去消化液的毒性,，細(xì)胞接種時(shí)濃度要稍大一些，少為5×108細(xì)胞/L,，培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng),，小牛血清濃度為10%～80%，有條件的應(yīng)在37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，在起始的2天中盡量減少振蕩,，以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落,，漂浮。若原代貼壁細(xì)胞不是用于長(zhǎng)期培養(yǎng),，只是用于分離繁殖或測(cè)定病毒之用,，其細(xì)胞濃度可以加大，盡量貼成厚層以利病毒的效價(jià)提高和測(cè)定結(jié)果（如空斑）更加明顯,、準(zhǔn)確,，待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，此時(shí)的pH若有明顯變化,，應(yīng)將原代細(xì)胞換液,，即倒去舊液，換入新鮮的培養(yǎng)基,，以便除去衰老,、死亡的細(xì)胞和陳舊的培養(yǎng)基，使貼壁細(xì)胞能獲得充足的營(yíng)養(yǎng),。   
若用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時(shí),，可有少量的肌樣纖維間質(zhì)細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，為了利于該貼壁細(xì)胞充分貼壁和生長(zhǎng),，此時(shí)換液應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后,，按半量換液方式棄去舊液加入新液，然后再將細(xì)胞懸液放入原瓶中繼續(xù)培養(yǎng),，經(jīng)反復(fù)幾次換液后,，貼壁肌樣細(xì)胞逐漸形成網(wǎng)狀，此時(shí)換液可將原懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)基移入另一新瓶,，然后分別補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基(也按半量換液方式分別對(duì)半加入新液)繼續(xù)培養(yǎng),，原瓶的貼壁細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層，而新瓶中又會(huì)出現(xiàn)二次貼壁細(xì)胞,，經(jīng)幾次換液也會(huì)逐漸長(zhǎng)成單層,，在此類細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中往往需加入少量的維生素D3,、bFGF、地塞米松,、小牛血清（濃度要在20%以上）,，以利細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。   

2,、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)   

凡來(lái)自外周血,、胸腹水、脾臟,、淋巴結(jié),、骨髓的淋巴細(xì)胞,、造血干細(xì)胞以及白血病細(xì)胞，在原代培養(yǎng)時(shí)要盡量去除紅細(xì)胞,。若作用于試驗(yàn)的短期培養(yǎng),，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞濃度可在5～8×109/L范圍內(nèi),，然后進(jìn)行分瓶試驗(yàn),。若要將淋巴細(xì)胞及白血病細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)，淋巴細(xì)胞中要加入生長(zhǎng)因子,，白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清,，以利細(xì)胞生長(zhǎng)，待細(xì)胞開(kāi)始增殖甚結(jié)成小團(tuán)塊,，培養(yǎng)基中pH變酸,，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時(shí)盡量使細(xì)胞不丟失）,，待細(xì)胞增殖加快,，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時(shí),，此時(shí)可考慮傳代,。但千萬(wàn)不能急于傳代，一定要待細(xì)胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行,，以防傳代失敗,。  

(二)原代細(xì)胞的維持   

1、貼壁細(xì)胞（包括半貼壁細(xì)胞的換液）   

貼壁細(xì)胞長(zhǎng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí),，由于營(yíng)養(yǎng)缺乏,，代謝產(chǎn)物增多，pH變酸,，不適宜細(xì)胞生長(zhǎng),，此時(shí)細(xì)胞還未長(zhǎng)成單層，未達(dá)到飽和密度,，仍需繼續(xù)培養(yǎng),，因此，需采取換液方式來(lái)更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的需要,。其換液方法比較簡(jiǎn)單,，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量*培養(yǎng)基,。若希望細(xì)胞能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)能維持存活,，但不需增殖，此時(shí)要換成含2%小牛血清的維持液,。   

2,、懸浮細(xì)胞   

凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)而不貼壁的細(xì)胞,，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)現(xiàn)象，淋巴細(xì)胞的短期培養(yǎng)無(wú)需換液,，但加入生長(zhǎng)因子或有絲分裂源（PHA,、PMA、COnA,、PWM,、LPS等）后，細(xì)胞不僅會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會(huì)發(fā)生分裂繁殖,，此時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求,，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸,，細(xì)胞不適宜生長(zhǎng),，需進(jìn)行換液。白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí),，都需換液培養(yǎng),，待達(dá)到飽和密度時(shí)才能傳代。換液時(shí),，只能采用半量換液的方式,，千萬(wàn)不能采取倒去舊液加入新液的方式進(jìn)行換液。 

半量換液的方法如下：   

將原培養(yǎng)瓶豎起,，在30分鐘內(nèi),，若細(xì)胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去,，再加入等量的新鮮*培養(yǎng)基,。若細(xì)胞不能沉于瓶底，可吸出細(xì)胞懸液,，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮*培養(yǎng)基,，混勻后再轉(zhuǎn)入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。   

二,、原代細(xì)胞培養(yǎng)的傳代   

原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖,，數(shù)量增加甚達(dá)飽和密度，貼壁細(xì)胞的相互匯合,，使整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋,，細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng),，這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過(guò)程稱之為傳代。每進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代,，傳5～10代以內(nèi)的細(xì)胞通常稱為次代培養(yǎng)細(xì)胞,，傳10~20代以上的細(xì)胞,，通常確定為傳代細(xì)胞（或稱傳代細(xì)胞系）。然而,，傳代細(xì)胞系的建立,，關(guān)鍵是初代培養(yǎng)的傳代。 

應(yīng)注意如下幾點(diǎn)：   

(1)細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí),，或未能達(dá)到覆蓋整個(gè)瓶底時(shí)不能急于傳代,。   

(2)原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞多為混雜細(xì)胞，形態(tài)各異,，往往是上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞并存,，采用胰蛋白酶消化時(shí)要掌握好消化時(shí)間，因成纖維細(xì)胞易于脫壁,，上皮細(xì)胞不易脫壁,，因此，可根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)南瘯r(shí)間及時(shí)中止消化,。在早先傳代時(shí),，其消化時(shí)間比一般已建系的細(xì)胞相對(duì)長(zhǎng)一些。   
(3)吹打已消化的細(xì)胞要輕巧,，既不能聽(tīng)到有明顯的吹打聲,，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷,。   

(4)傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些,，以利于細(xì)胞的生存和繁殖。如果消化分離的細(xì)胞懸液有組織塊,，也一并傳入到培養(yǎng)瓶,，盡量減少細(xì)胞損失。   

(5)傳代培養(yǎng)時(shí)的pH不能高,，寧可偏低一些,。此外，小牛血清濃度可適當(dāng)加大15%～20%左右,。   

三,、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)   

原代細(xì)胞經(jīng)傳代后所形成的傳代細(xì)胞，可根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法進(jìn)行細(xì)胞傳代,。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代,，部分貼壁的細(xì)胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細(xì)胞可采用加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散進(jìn)行傳代,，或用自然沉降法加入新培養(yǎng)基后再吹打分散進(jìn)行傳代,。后兩種傳代方法比較簡(jiǎn)單，唯有貼壁細(xì)胞的消化傳代法比較復(fù)雜一些,。 

現(xiàn)將具體方法介紹如下：   

(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）,。   

(2)每瓶加入2mL,，無(wú)鈣、鎂PBS,，漂洗一次后倒掉,。   

(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02鞹A或混合液），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面,，待細(xì)胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時(shí),，倒掉消化液,，再繼續(xù)作用2～3分鐘，輕輕搖動(dòng),，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來(lái),，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大,，此時(shí)應(yīng)立即終止消化,。   

(4)加入*培養(yǎng)基5mL，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞,，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行,，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔,，不要用力過(guò)大,，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷,。   

(5)用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),，計(jì)算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng),。   

四,、傳代細(xì)胞的建系和維持   

細(xì)胞系的維持是培養(yǎng)工作的重要內(nèi)容，是通過(guò)換液傳代再換液,、再傳代和細(xì)胞種子凍存來(lái)實(shí)現(xiàn)的,，但對(duì)每一個(gè)細(xì)胞系來(lái)說(shuō)都有其自身的特點(diǎn)，要做好建系的維持須注意以下幾點(diǎn)：   

1.細(xì)胞檔案   

細(xì)胞檔案要記錄好,，如組織來(lái)源,、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長(zhǎng)繁殖曲線,、染色體核型情況,、代謝特性、分化特性、病毒敏感性,、致瘤特性,、有無(wú)支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求,、傳代換液時(shí)間、擴(kuò)增時(shí)間(分裂指數(shù)),，細(xì)胞的特殊遺傳標(biāo)志(標(biāo)記染色體)等,，這些記錄對(duì)于保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，保持細(xì)胞的一致和經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞特性的變異比較,，都有十分重要的意義,。   

2.換液傳代   

(1)細(xì)胞系的傳代、換液方法與前相同,，但一般都有自身的規(guī)律性,，因而在繼續(xù)傳代時(shí)，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性,，這樣可以減少由于傳代時(shí)細(xì)胞密度的頻繁增減或換液時(shí)間的不規(guī)律而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)特性的改變,，給以后的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)影響。   

(2)多種細(xì)胞系維持傳代,，要嚴(yán)格操作程序,，對(duì)所用的試劑各系不能交叉，甚每個(gè)細(xì)胞系均需單獨(dú)實(shí)驗(yàn)室,，傳代時(shí)各系均分開(kāi)單獨(dú)操作,，每傳5代后，細(xì)胞種子均應(yīng)凍存,。傳代時(shí)均應(yīng)作好記錄,，培養(yǎng)瓶上要有明顯標(biāo)記，標(biāo)記細(xì)胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時(shí)間,。若細(xì)胞生長(zhǎng)較快,，可減去換液程序，每次均可傳代,。每個(gè)傳代細(xì)胞系,，能分成2～3條線，分別傳代,，同時(shí)也可在適溫或4℃短期存放一瓶,，以防止污染丟失。細(xì)胞種子的及時(shí)凍存不僅可防止污染丟失,，而且還可防止因盲目傳代而造成細(xì)胞變異,，此外還可提供不同代次的細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。   

3.細(xì)胞系（或株）的鑒定和管理   

當(dāng)一個(gè)細(xì)胞系（或株）建立后，專家鑒定可有可無(wú),，按慣例,，只要認(rèn)真研究，記錄完整,，資料和結(jié)果確切,，就可在有關(guān)雜志上或刊物上報(bào)道細(xì)胞的各次實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。   

下面為美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)或細(xì)胞銀行（ATCC）入庫(kù)細(xì)胞的基本要求：   

（1）培養(yǎng)簡(jiǎn)歷 組織來(lái)源日期,、物種,、組織來(lái)源、性別,、年齡,、供體正常或異常健康狀態(tài),，細(xì)胞已傳代數(shù)等,。   

（2）凍存液 培養(yǎng)基和保護(hù)劑名稱。   

（3）細(xì)胞活力 凍融前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性(生長(zhǎng)繁殖曲線,，分裂指數(shù)等),。   

（4）培養(yǎng)液 培養(yǎng)基種類和名稱、血清來(lái)源及濃度,。   

（5）細(xì)胞形態(tài) 類型,，如上皮或成纖維細(xì)胞等。   

（6）核型 二倍體或多倍體,，標(biāo)記染色體有或無(wú),。   

（7）無(wú)污染情況 包括細(xì)胞、真菌,、支原體,、原蟲(chóng)和病毒等。   

（8）物種檢測(cè) 檢測(cè)同功酶,，主要為G6PD和LDH,，以證明細(xì)胞有無(wú)交叉污染。   

（9）免疫檢測(cè) 一兩種血清學(xué)檢測(cè),。   

（10）細(xì)胞建立者 建立者姓名,、檢測(cè)者姓名。    

第四節(jié) 細(xì)胞的純化和克隆   

體外培養(yǎng)的細(xì)胞源于人或動(dòng)物體內(nèi)或胚胎組織,，其體內(nèi)的細(xì)胞都是混雜生長(zhǎng),，每一種組織都有血管和間葉組織，因此,，來(lái)源于上述組織的培養(yǎng)材料的原代細(xì)胞,、傳代細(xì)胞絕大多數(shù)都呈混合生長(zhǎng),，即有上皮樣細(xì)胞，又有纖維樣細(xì)胞,，纖維樣細(xì)胞又包括成纖維細(xì)胞,、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞,、滑膜細(xì)胞等,，混雜的細(xì)胞會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而利用體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí),，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,、一致性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性,，要求采用單一種類細(xì)胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣才能對(duì)某一細(xì)胞的功能,、形態(tài)等變化進(jìn)行一系列研究,，因而培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為實(shí)驗(yàn)研究的重要一步，甚需要從混雜的細(xì)胞群中分離出單個(gè)細(xì)胞來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)和開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究,。   

一,、細(xì)胞的純化   

細(xì)胞的純化一般分為兩種，即自然純化和人工純化,?？筛鶕?jù)不同細(xì)胞種類、來(lái)源,、實(shí)驗(yàn)要求和目的選擇采用,。   

(一)自然純化   

自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法,，不斷排擠其他生長(zhǎng)慢的細(xì)胞,，靠自然增殖的潛力，zui后留下生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)旺的細(xì)胞,，達(dá)到細(xì)胞純化的目的,。但這種方法常無(wú)法按照需要和實(shí)驗(yàn)要求及目的來(lái)選擇細(xì)胞，此法花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),，留下來(lái)的往往是成纖維細(xì)胞,。僅有那些惡性變的腫瘤細(xì)胞或突變的細(xì)胞可以通過(guò)此方法而保留下來(lái)，不斷純化而建立細(xì)胞系,。   

(二)人工純化   

人工純化,，即利用人為手段造成某一細(xì)胞生長(zhǎng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長(zhǎng)從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的,。   

1,、細(xì)胞因子依賴純化法   

人和動(dòng)物組織中某些細(xì)胞需要有特殊的細(xì)胞因子存在的微環(huán)境才能長(zhǎng)期存活和生長(zhǎng)繁殖,，如IL-2是T細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的細(xì)胞因子，BCGF是B細(xì)胞的生長(zhǎng)因子,，體外培養(yǎng)中淋巴細(xì)胞若加入IL-2就可使T細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖,，形成IL-2依賴的T細(xì)胞系，如CTLL-2細(xì)胞株,，而其他細(xì)胞則自然被淘汰,，采用此法還建立了IL-6依賴的細(xì)胞系，如B9,、CTD7細(xì)胞株,。   

2、酶消化法   

酶消化法是比較常用的純化方法,，不僅對(duì)貼壁細(xì)胞可行,，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開(kāi),，達(dá)到純化的目的,，對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。   

（1）上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化   

兩者在胰蛋白酶的作用下,，由于成纖維細(xì)胞先脫壁,，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁，特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯,，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開(kāi),。 

方法如下：   

①采用常規(guī)消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)兩次，每次加1mL（25mL培養(yǎng)瓶）來(lái)回輕搖1-2次,，使胰蛋白酶流過(guò)所有細(xì)胞表面,，然后倒掉。   

②蓋好瓶塞（或蓋）,，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察,，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓，部分脫落,，立即加入2mL有血清的培養(yǎng)液終止消化,。   

③用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域（可事先在鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號(hào)）。吹打時(shí)不要用力,，也不要吹打上皮細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域,。吹打結(jié)束后，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍,，然后加入適量培養(yǎng)液于瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng),，也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次，隔幾日后或下次傳代時(shí),，再進(jìn)行上述操作,，經(jīng)過(guò)幾次處理,，就可將成纖維細(xì)胞去除或?qū)烧叻珠_(kāi)。   

（2）骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化   

在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí),，常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),，但也有許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞,、粒細(xì)胞粘附其上,，種類混雜，鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固,，也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離,，以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分開(kāi)和純化的目的。 

其方法如下：   

①待基質(zhì)或肌樣細(xì)胞基本形成單層時(shí),，倒去舊液,，加入無(wú)鈣、鎂PBS漂洗,，并用力搖動(dòng)后倒掉,，反復(fù)洗2~3次后，一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化,，另一方面又可使大部分粘附細(xì)胞被洗掉，但仍留有不少粘附細(xì)胞,。   

②將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),，每瓶1mL（25mL培養(yǎng)瓶），輕輕搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過(guò)細(xì)胞表面,，作用1~2分鐘后再輕輕搖動(dòng)1~2次后倒去,。   

③蓋好瓶蓋，在普通顯微鏡下觀察,，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)或肌樣細(xì)胞由于貼壁較牢固未脫壁,，而原先粘附的細(xì)胞已浮起，此時(shí)再加2mL PBS洗一次倒掉,，盡量除去粘附細(xì)胞,。   

④加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，再繼續(xù)用力搖動(dòng)后倒掉,，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。隔幾日或下次傳代前，再進(jìn)行上述操作,，經(jīng)過(guò)幾次處理和傳代培養(yǎng)后就可將粘附細(xì)胞去除,，將兩者分開(kāi)，達(dá)到使骨髓基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞純化的目的,。   

3,、機(jī)械刮除法   

原代培養(yǎng)時(shí),如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長(zhǎng),，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長(zhǎng)在瓶壁上?？刹捎脵C(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域,。

其方法如下：   

(1)將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，在凈化室內(nèi)放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行,。   

(2)用硅橡皮刮子在不需要生長(zhǎng)的細(xì)胞區(qū)域推劃,，使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，注意不要傷及所需細(xì)胞,。   

(3)推劃后用培養(yǎng)液沖洗振搖兩次倒掉,，即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。   

(4)數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長(zhǎng)出,，可再進(jìn)行上述操作,，這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。操作過(guò)程中要嚴(yán)格無(wú)菌操作,，防止污染,。   

4、反復(fù)貼壁法   

成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比,，其貼壁過(guò)程快,，大部分細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)（大約10~30min）完成附著過(guò)程（但不一定*伸展），而上皮細(xì)胞（大部分）在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定,，稍加振蕩即浮起,，利用此差別可以純化細(xì)胞。 

其方法如下：   

(1)將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)（培養(yǎng)液內(nèi)不含血清,，此時(shí)上皮細(xì)胞貼壁更慢）靜置20分鐘,。   

(2)在倒置顯微鏡下觀察，見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁,，稍加搖動(dòng)也不浮起時(shí),，將細(xì)胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min,，然后再重復(fù)上述操作后,，即可將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分隔開(kāi)，在第1瓶和第2瓶以成纖維細(xì)胞為主,，往后幾瓶即以上皮細(xì)胞為主,，下次傳代時(shí)再按上述方法處理，就可使兩者達(dá)到*分開(kāi)的目的,。   

5,、電烙篩選法   

在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，往往在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會(huì)出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，轉(zhuǎn)化灶區(qū)域細(xì)胞密集,、排列規(guī)則，有明顯生長(zhǎng)趨勢(shì),，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限,，此時(shí)即可用機(jī)械刮除法去除未轉(zhuǎn)化細(xì)胞,，也可用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。 

其方法如下：   

(1)倒去舊液,，并用記號(hào)筆劃出轉(zhuǎn)化灶的區(qū)域,。   

(2)用加熱的微型電烙器(類似焊接用的電烙鐵)將轉(zhuǎn)化灶周邊的細(xì)胞全部燙死，只保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞,。在單細(xì)胞克隆篩選時(shí),，也可用此法將單個(gè)細(xì)胞周圍的細(xì)胞殺死，然后在適應(yīng)性培養(yǎng)基中（50%是舊液）繼續(xù)培養(yǎng),，即可達(dá)到純化的目的,。   

二、細(xì)胞的克隆化   

        細(xì)胞克隆技術(shù)又稱單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù),，即從細(xì)胞群體中分離出一個(gè)細(xì)胞,，并使其在體外培養(yǎng)體系中能繁殖成新的細(xì)胞群體，這種由單個(gè)細(xì)胞所形成的細(xì)胞群（或集落）稱為一個(gè)克隆,，這種純化后的細(xì)胞群體稱為細(xì)胞株,。它們當(dāng)中每個(gè)細(xì)胞的遺傳特征和生物學(xué)特性極為相似和一致，有利于對(duì)不同群體細(xì)胞的形態(tài)和功能進(jìn)行比較和研究,。若該細(xì)胞株只是一般傳代,、無(wú)一系列實(shí)驗(yàn)鑒定指標(biāo)，則為一般細(xì)胞株,。若有一系列實(shí)驗(yàn)指標(biāo)報(bào)道的，則稱為限定性細(xì)胞株,，如由幼地鼠腎細(xì)胞系（BHK21）第13孔的單個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞株稱BHK-21C-13（代表克隆13）,，其形態(tài)規(guī)則，特性穩(wěn)定,，便于研究,。   

        單一細(xì)胞體外培養(yǎng)能否生長(zhǎng)繁殖zui后形成克隆，這與各細(xì)胞克隆形成率有關(guān),，如果細(xì)胞克隆形成率偏低（小于10%）應(yīng)采用一些措施,，如改用胎牛血清，適應(yīng)性培養(yǎng)基添加刺激因子（如胰島素,、地塞米松,、細(xì)胞生長(zhǎng)因子等），調(diào)節(jié)CO2濃度以控制pH,。若貼壁效果差可選用適當(dāng)?shù)倪m應(yīng)性底物（如膠原層或血漿纖維蛋白層）,，以及制備底層的飼養(yǎng)細(xì)胞,。用X線或60Co照射處理的細(xì)胞層，如雞胚細(xì)胞,、骨髓基質(zhì)細(xì)胞,，該細(xì)胞照光后只有代謝功能，無(wú)增殖和傳代能力,，或選用短壽的細(xì)胞,，常選用鼠腹水巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞，用于單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的克隆化,。 

具體克隆方法如下：   

1.毛細(xì)管法：   

將一定量的細(xì)胞懸液（如105/mL或更低）稀釋1個(gè)細(xì)胞/mL,，取10mL稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為0.5mm,，長(zhǎng)為8mm的毛細(xì)玻璃管若干（30～50只）,，在負(fù)壓作用下，使懸液吸入各毛細(xì)管中,，在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管,，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)板）內(nèi)，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，由一個(gè)細(xì)胞在毛細(xì)管繁殖后,，并向管外擴(kuò)展，并形成單個(gè)克隆的細(xì)胞群體,。   

2.有限稀釋法   

有限稀釋法采用梯變倍數(shù)稀釋的原則,，將稀釋的細(xì)胞懸液接種于微孔培養(yǎng)板中（也可在板上的96孔中直接稀釋）培養(yǎng)一定時(shí)間后，孔中可出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞克隆,，本法不需特殊設(shè)備,，操作簡(jiǎn)單快速，適合大批量克隆化培養(yǎng)?，F(xiàn)已廣泛用于異質(zhì)性細(xì)胞系的克隆化培養(yǎng),、誘導(dǎo)和分離耐藥性或高轉(zhuǎn)移性、或突變細(xì)胞株以及單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的克隆篩選中,。 

具體方法如下：   

（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成),，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，測(cè)定活細(xì)胞數(shù)及濃度（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)高于90%以上）,。   

（2）將細(xì)胞懸液在試管中稀釋,，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋50個(gè)細(xì)胞/mL、10個(gè)細(xì)胞/mL,、5個(gè)細(xì)胞/mL,，將3種稀釋度的細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔為0.1mL，于37℃ 5%CO2下培養(yǎng),。   

（3）次日在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔中的細(xì)胞數(shù),，挑選只含一個(gè)細(xì)胞的孔，做好標(biāo)記并補(bǔ)加0.1mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),。   

（4）培養(yǎng)期間,，視pH值的變化決定是否換液或補(bǔ)加培養(yǎng)液，一周左右,，孔中有明顯克隆出現(xiàn),，待長(zhǎng)孔底面的1/3～1/2時(shí)，可用消化法將96孔中的單一克隆的細(xì)胞分別移24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),。  

3.平皿克隆分離法   
        在平皿內(nèi)將單個(gè)細(xì)胞形成克隆并進(jìn)行分離培養(yǎng)的方法如下：   

(1)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備單個(gè)細(xì)胞懸液（懸浮細(xì)胞用吸管吹打分散,，貼壁細(xì)胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培養(yǎng)基吹打分散）計(jì)數(shù)并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度,，使5mL培養(yǎng)液內(nèi)含有50～200個(gè)細(xì)胞（細(xì)胞存活率及單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)大于90%以上）,。   

(2)將上述細(xì)胞懸液迅速移入60mm平皿中，在37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1周或更長(zhǎng),。若有明顯的克隆形成時(shí)方可進(jìn)行克隆分離,，方法有兩種：   

①套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀察克隆形成的情況， 標(biāo)記單個(gè)克隆周邊,，吸干培養(yǎng)基,，用涂有少量無(wú)菌硅脂的無(wú)菌金屬套環(huán)，套住標(biāo)記的克隆,，在套環(huán)內(nèi)滴加少量0.25%胰蛋白酶,，待細(xì)胞脫離時(shí)，用注射器針頭輕輕吹打分散后,，轉(zhuǎn)入小平皿或24孔板或6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng),。   

②玻片法：在接種細(xì)胞懸液前，預(yù)先在60mm平皿中放入無(wú)菌小玻片,，加入細(xì)胞懸液,，培養(yǎng)一定時(shí)間后，在倒置顯微鏡下標(biāo)記上含一個(gè)克隆的玻片,，然后用無(wú)菌鑷子取出標(biāo)記玻片轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng),。   

4.軟瓊脂克隆分離法   

本法僅適用于懸浮培養(yǎng)的類淋巴細(xì)胞或惡性程度高的貼壁細(xì)胞,，而正常貼壁細(xì)胞在軟瓊脂中不能形成克隆,。   

（1）將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液(貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成單個(gè)細(xì)胞)作活細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度1×106細(xì)胞/L,，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求再作梯倍稀釋,。通常以1~5×104個(gè)細(xì)胞/L為佳。   

（2）制備底層瓊脂 取5%瓊脂置沸水中，使瓊脂*溶化,，取出一份5%瓊脂,，移入小燒杯中，待冷50℃,，迅速加入9份預(yù)溫37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為0.5%瓊脂）,，混勻后立即注入24孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5% 瓊脂0.8mL,，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）,。   

（3）制備上層瓊脂 取37℃保溫的、不同濃度的細(xì)胞懸液9.4mL,，移入小燒杯中,，加入50℃ 5% 瓊脂0.6mL迅速混勻，即配成0.3%瓊脂培養(yǎng)基,，立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養(yǎng)板中,，每孔0.8ml，置室溫使瓊脂凝固,。   

（4）于37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1~2周或更長(zhǎng),，若需培養(yǎng)更長(zhǎng)時(shí)間可補(bǔ)加0.8mL/孔含瓊脂的培養(yǎng)液，待有明顯集落形成為止,。   

（5）集落（克?。┯?jì)數(shù)：在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)直徑大于75μm或含有50個(gè)細(xì)胞以上的克隆。  

5．單細(xì)胞顯微操作法   

借助顯微操縱器,，在顯微鏡監(jiān)控下將單個(gè)細(xì)胞逐個(gè)吸出,，移入含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。本法準(zhǔn)確性好,，如無(wú)顯微操縱器可自制毛細(xì)吸管替代,。

方法如下：   

（1）飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備 單個(gè)細(xì)胞在極低密度下生長(zhǎng)非常緩慢，甚難以分裂,，為了促進(jìn)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖,，常采用飼養(yǎng)層細(xì)胞，飼養(yǎng)細(xì)胞種類和制備方法依實(shí)驗(yàn)要求而定,，現(xiàn)以3T3小鼠纖維細(xì)胞為例：   

①用0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長(zhǎng)的3T3細(xì)胞,，調(diào)整細(xì)胞濃度為108細(xì)胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL細(xì)胞懸液于37℃ 5% CO2中培養(yǎng)單層,。   

(2)制備單個(gè)細(xì)胞懸液 方法同上,。   

(3)分離單個(gè)細(xì)胞 其方法多樣，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件決定：   

①毛細(xì)管吸入法 同上述毛細(xì)管法,，在顯微鏡下將只有一個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管取出,。   

②微滴法 將經(jīng)稀釋103個(gè)細(xì)胞/L的單個(gè)細(xì)胞懸液，用無(wú)菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個(gè)細(xì)胞的液滴,，再用毛細(xì)管取出單個(gè)細(xì)胞懸滴,。   

③液體石蠟法 將經(jīng)稀釋103個(gè)細(xì)胞/L的單個(gè)細(xì)胞懸液，用無(wú)菌的1mL注射器逐滴加入充滿無(wú)菌液體石蠟的平皿底部,，在倒置顯微鏡下挑選只有一個(gè)細(xì)胞液滴,，仔細(xì)用毛細(xì)吸管取出有一個(gè)細(xì)胞的液滴。   

④玻璃小球附著法 將稀釋103個(gè)細(xì)胞/L的細(xì)胞懸液加入表面涂有無(wú)菌凡士林石蠟的小玻璃珠的平皿中,，混勻后,，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個(gè)細(xì)胞的玻珠，仔細(xì)用鑷子取出,。   

(4)將采用上述方法分離出的單個(gè)細(xì)胞,，放入預(yù)先制備飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，于37℃ 5% CO2下培養(yǎng)1~2周或更長(zhǎng),。   

(5)待細(xì)胞克隆明顯,，并使孔底覆蓋1/3～1/2時(shí)，即可將細(xì)胞轉(zhuǎn)種于24孔板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)（貼壁細(xì)胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉(zhuǎn)種）,。