名稱    大隱靜脈平滑肌細胞

2.組織來源：大隱靜脈組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

人大隱靜脈平滑肌細胞分離自大隱靜脈；大隱靜脈起于足背靜脈弓內(nèi)側(cè)端,，經(jīng)內(nèi)踝前方，沿小腿內(nèi)側(cè)緣伴隱神經(jīng)上行,，經(jīng)股骨內(nèi)側(cè)髁后方,，進入大腿內(nèi)側(cè)部，與股內(nèi)側(cè)皮神經(jīng)伴行,，逐漸向前上,，在恥骨結(jié)節(jié)外下方穿隱靜脈裂孔，匯入股靜脈,，其匯入點稱為隱股點,。有5條屬支：旋髂淺靜脈、腹壁淺靜脈,、外靜脈,、股內(nèi)側(cè)淺靜脈和股外側(cè)淺靜脈，它們匯入大隱靜脈的形式多樣,，相互間吻合豐富,。大隱靜脈曲張行高位結(jié)扎時，須分別結(jié)扎,、切斷各屬支,，以防復(fù)發(fā)。大隱靜脈平滑肌細胞主要功能：①血管平滑肌細胞的生長潛力是原發(fā)血管病發(fā)的重要異常因素,；②參與血管壁的炎癥反應(yīng),，并與血管疾病的進展和穩(wěn)定有關(guān)。因此,，研究大隱靜脈平滑肌細胞的代謝和信號通路是研究大隱靜脈擴張等疾病的良好實驗材料,。大隱靜脈平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見細胞貼壁伸展,，細胞形態(tài)大小不一,，呈梭形、不規(guī)則形,、三角形或扇形,，核卵圓形,、居中；2周后細胞匯合,，多數(shù)細胞伸展呈長梭形,，胞漿豐富，有分枝狀突起,，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長,，高低起伏；細胞密度低時,，常交織成網(wǎng)狀,；密度高時，則排列為旋渦狀或柵欄狀,。傳代后細胞生長較快,，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長特點,。

5.方法簡介：

實驗室分離的人大隱靜脈平滑肌細胞采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質(zhì)量檢測：

實驗室分離的人大隱靜脈平滑肌細胞經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌,、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-H086

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)成纖維細胞樣

傳代特性可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品特點:

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2,、 可以處理各種細菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3,、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低,。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等,。

8、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容,。

細胞處理：

1） 復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級等級,，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存,，勿作多次解凍,。使用的甘油也應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6,，依細胞種類而異,。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時,，亦應(yīng)作一個backup culture,，以防止冷凍失敗。

收到細胞后,，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng),。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M行接種傳代,，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。