收到細胞后,，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒，拆下封口膜,，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng),。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當?shù)谋壤M行接種傳代,，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。

產(chǎn)品名稱

名稱    2V6.11 (胚腎細胞)

種屬人類

年齡（性別）男性，胎兒

組織來源腎,；用腺病毒5(Ad5)DNA轉(zhuǎn)化,；用腺病毒前區(qū)4質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染

生長特性貼壁細胞

細胞形態(tài)上皮細胞樣

背景描述2V6.11細胞是2001年從人胚腎細胞株293 [HEK-293]衍化而來，293 [HEK-293]細胞用攜帶Zeocin-抗性標記的質(zhì)粒pVgRXR轉(zhuǎn)染得到293pVgRXR細胞,。隨后,，用包含編碼E4 24K的Ad5 E4ORF6基因的質(zhì)粒pEKORF6轉(zhuǎn)染。pEKORF6從包含潮霉素抗性基因的質(zhì)粒pIndHydro衍生而來,，載體包含SV40病毒序列,。2V6.11細胞株最初從含潮霉素的培養(yǎng)液中用克隆環(huán)分離單克隆得到。2V6.11細胞誘導表達的人腺病毒E4 34KDa蛋白可通過免疫印跡法檢測,；2V6.11細胞可以用作研究腺病毒E4癌基因的工具,。

生長培養(yǎng)基MEM＋10% FBS＋1% P/S

推薦傳代比例1:2-1:4

推薦換液頻率2~3次/周

凍存條件

凍存液：55% 基礎培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO

溫度：液氮

培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

溫度：37℃

產(chǎn)品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設備。

2,、 可以處理各種細菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體,。

3,、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4,、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性。

5,、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定。

6,、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低。

7,、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑,；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等。

8,、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度,。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一,、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前,，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質(zhì),，例如是否有雜細胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存,，勿作多次解凍。使用的甘油也應為試劑級等級,，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性,。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后,。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6,，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture,，以防止冷凍失敗,。