收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng),。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察,，待細胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻,，按1:2或1:3等適當?shù)谋壤M行接種傳代,，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察,。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。

產(chǎn)品名稱

名稱    肝竇內(nèi)皮細胞

2.組織來源：肝臟組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

人肝竇內(nèi)皮細胞細胞分離自肝臟組織；肝臟是身體內(nèi)以代謝功能為主的一個器官,，并在身體里面起著去氧化,、儲存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用,；肝臟也消化系統(tǒng)中之膽汁,。肝臟是機體內(nèi)臟里最大的器官,，位于機體中的腹部位置,，在右側(cè)橫隔膜之下，位于膽囊之前端且于右邊腎臟的前方,，胃的上方,。肝臟是機體消化系統(tǒng)中最大的消化腺，為一紅棕色的V字形器官,。肝臟是尿素合成的主要器官,，又是新陳代謝的重要器官。肝臟在機體位置和形態(tài)結(jié)構(gòu)：肝臟位于右上腹,，隱藏在右側(cè)膈下和肋骨深面,，大部分肝為肋弓所復蓋，僅在腹上區(qū),、右肋弓間露出并直接接觸腹前壁,，肝上面則與膈及腹前壁相接。肝竇內(nèi)皮細胞（SEC）是肝臟內(nèi)所占比例最高的非實質(zhì)細胞,，位于肝竇腔與肝細胞之間,，具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運、吞噬,、抗原提呈,、免疫耐受等功能。SEC由于擁有一般細胞所沒有的窗孔結(jié)構(gòu),、細胞間連結(jié)松散,、內(nèi)皮下缺少基底膜而使其具有高度通透性，從而達到快速交換各種大小分子的目的,。肝在遭到多種病原侵襲時,，肝竇內(nèi)皮細胞窗孔逐漸減少或消失,，內(nèi)皮下基膜形成，產(chǎn)生類似于連續(xù)型毛細血管的結(jié)構(gòu),，這一過程稱為肝竇毛細血管化,。它由多種因素引起，其過程極復雜,，在多種肝病的發(fā)病前期階段均有出現(xiàn),，近年來受到廣泛關(guān)注。

5.方法簡介：

實驗室分離的人肝竇內(nèi)皮細胞采用混合酶灌流消化,、反復低速離心,、密度梯度離心法，并通過內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測：

實驗室分離的人肝竇內(nèi)皮細胞經(jīng)CD31、CD14免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌,、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

包被條件PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-H047

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)內(nèi)皮細胞樣

傳代特性可傳1-2代

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

產(chǎn)品特點:

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備,。

2、 可以處理各種細菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體,。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4,、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性,。

5,、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定。

6,、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低。

7,、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑,；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等。

8,、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度,。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一,、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質(zhì),，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級,，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存，勿作多次解凍,。使用的甘油也應為試劑級等級,，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長期儲存后對細胞會有毒性,。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后,。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異,。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時,，亦應作一個backup culture,，以防止冷凍失敗。