產(chǎn)品名稱

名稱    小鼠心肌成纖維細(xì)胞

2.組織來源：心臟組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡(jiǎn)介：

小鼠心肌成纖維細(xì)胞分離自心臟組織,；心臟由心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞組成,，非心肌細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的70%，其中90%以上的非心肌細(xì)胞由心肌成纖維細(xì)胞組成,。成纖維細(xì)胞（Fibroblast）是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分,，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來。成纖維細(xì)胞較大,，輪廓清楚,，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形,，核仁大而明顯,。成纖維細(xì)胞功能活動(dòng)旺盛，細(xì)胞質(zhì)嗜弱堿性,，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng),，在一定條件下，它可以實(shí)現(xiàn)跟纖維細(xì)胞的互相轉(zhuǎn)化,；成纖維細(xì)胞對(duì)不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損的修復(fù)有著十分重要的作用,。剛分離的心肌成纖維細(xì)胞呈圓形,、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中,。30min細(xì)胞貼壁,，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起,；6h后細(xì)胞基本貼壁*,，伸展成梭形，胞核清晰,，分布較均勻,，散在生長(zhǎng)，不聚集成團(tuán),；細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,，5-7天即呈融合狀態(tài),，細(xì)胞排列緊密，有的交叉重疊生長(zhǎng),，平坦,、胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明,，細(xì)胞核較大,，呈橢圓形，顏色淡,。細(xì)胞融合,，并彼此連接成網(wǎng)狀；細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,。近年來,，人們逐漸了解到非心肌細(xì)胞不僅對(duì)心肌細(xì)胞具有結(jié)構(gòu)上的支持、保護(hù)作用,，而且還具有自分泌和旁分泌功能,，影響心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理功能；心肌成纖維細(xì)胞主要功能為對(duì)心肌細(xì)胞起結(jié)構(gòu)支持作用并負(fù)責(zé)細(xì)胞基質(zhì)外的合成,，當(dāng)心肌損傷時(shí)能產(chǎn)生旁分泌生長(zhǎng)因子,。心肌成纖維細(xì)胞是心臟結(jié)締組織中最常見的細(xì)胞，可合成和分泌膠原纖維,、彈性纖維,、網(wǎng)狀纖維及有機(jī)基質(zhì)，并且在外傷等因素刺激下,，部分纖維細(xì)胞可重新轉(zhuǎn)變?yōu)橛字傻某衫w維細(xì)胞,，其功能活動(dòng)也得以恢復(fù)，參與組織損傷后的修復(fù),。因此,，對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的生理學(xué)研究成為現(xiàn)代心血管領(lǐng)域研究的一個(gè)重點(diǎn)。

5.方法簡(jiǎn)介：

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠心肌成纖維細(xì)胞采用膠原酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化結(jié)合差速貼壁法制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測(cè)：

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS,、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號(hào)CM-M074

換液頻率每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性貼壁

細(xì)胞形態(tài)成纖維細(xì)胞樣

傳代特性可傳3代左右

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

產(chǎn)品特點(diǎn):

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備,。

2、 可以處理各種細(xì)菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體,。

3、 將蛋白提取的時(shí)間縮短至30分鐘-1小時(shí),。

4,、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性,。

5,、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6,、 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低,。

7,、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑,；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等,。

8、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容,。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對(duì)于貼壁細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一、凍存時(shí)的注意事項(xiàng)：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存,，勿作多次解凍,。使用的甘油也應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細(xì)胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6,，依細(xì)胞種類而異,。腺癌類的細(xì)胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí),，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,，以防止冷凍失敗。

收到細(xì)胞后,，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜，放入37℃,，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過夜,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代,，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細(xì)胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。