產(chǎn)品名稱

名稱    退行性椎間盤髓核細胞

2.組織來源：椎間盤組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

人退行性椎間盤髓核細胞分離退行性椎間盤組織；椎間盤是位于脊柱兩椎體之間,，分為中央部的髓核,，富于彈性的膠狀物質(zhì),；周圍部的纖維環(huán)，由多層纖維軟骨環(huán)按同心圓排列,。上下有軟骨板,，是透明軟骨復蓋于椎體上，下面骺環(huán)中間的骨面,。上下的軟骨板與纖維環(huán)一起將髓核密封起來,。纖維環(huán)由膠原纖維束的纖維軟骨構成，位于髓核的四周,。纖維環(huán)的纖維束相互斜行交叉重疊，使纖維環(huán)成為堅實的組織,，能承受較大的彎曲和扭轉(zhuǎn)負荷,。髓核，是乳白色半透明膠狀體,，富于彈性,，為椎間盤結構的一部分，位于兩軟骨板與纖維環(huán)之間,。由縱橫交錯的纖維網(wǎng)狀結構即軟骨細胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構成的彈性膠凍物質(zhì),。嬰幼兒時期的髓核含水量為80%-90%，即使到了老年,，其含水量也在70%上下,。髓核在出生時體積大而松散，位于椎間盤的中央,，至成年時位置移至椎間盤的中后部,；在成年以前構成髓核的主要物質(zhì)是大量蛋白多糖復合體、膠原纖維和纖維軟骨,，隨著年齡的增長,，髓核中的蛋白多糖解聚增多，水分逐漸減少,，膠原增粗并逐漸被纖維軟骨所替代,。

5.方法簡介：

實驗室分離的人退行性椎間盤髓核細胞采用膠原酶-中性蛋白酶混合消化法并結合軟骨細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測：

實驗室分離的人退行性椎間盤髓核細胞經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-H170

換液頻率每3-4天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)梭形、多角形

傳代特性可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

產(chǎn)品特點:

1,、 使用方便:不需昂貴設備。

2,、 可以處理各種細菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3,、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低,。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等,。

8、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容,。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度,。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一,、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前,，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質(zhì),，例如是否有雜細胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存,，勿作多次解凍。使用的甘油也應為試劑級等級,，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性,。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后,。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6,，依細胞種類而異,。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時,，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗,。

收到細胞后,，請按照以下方法進行操作,。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒,，拆下封口膜,，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng)。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察,，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻,，按1:2或1:3等適當?shù)谋壤M行接種傳代，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察,。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。