收到細(xì)胞后,，請按照以下方法進(jìn)行操作,。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜,，放入37℃,，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻,，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代,，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃,，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細(xì)胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察,。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。

產(chǎn)品名稱

名稱    兔胰腺星狀細(xì)胞

2.組織來源：胰腺組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡介：

兔胰腺星狀細(xì)胞分離自胰腺組織,；胰腺分為外分泌腺和內(nèi)分泌腺兩部分,。外分泌腺由腺泡和腺管組成，腺泡分泌胰液,，腺管是胰液排出的通道,。胰液中含有碳酸氫鈉、胰蛋白酶原,、脂肪酶,、淀粉酶等。胰液通過胰腺管排入十二指腸,，有消化蛋白質(zhì),、脂肪和糖的作用。內(nèi)分泌腺由大小不同的細(xì)胞團(tuán)──胰島所組成,，胰島主要由4種細(xì)胞組成：α細(xì)胞,、β細(xì)胞、γ細(xì)胞及PP細(xì)胞,。α細(xì)胞分泌胰高血糖素,，升高血糖；β細(xì)胞分泌胰島素,，降低血糖,；γ細(xì)胞分泌生長抑素，以旁分泌的方式抑制α、β細(xì)胞的分泌,；PP細(xì)胞分泌胰多肽,，抑制胃腸運(yùn)動、胰液分泌和膽囊收縮,。纖維化是慢性胰腺炎的典型病理特征,，活化的胰腺星狀細(xì)胞（PSC）是胰腺纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，PSC分離和成功培養(yǎng)是體外研究胰腺纖維化的重要前提,。未活性化的PSC胞漿中富含維A脂滴,，并表達(dá)Desmin蛋白，活化后的PSC則表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（alpha-SMA）,。PSC具有靜息態(tài)與激活態(tài)兩種,，并分別具有特異的標(biāo)志物。靜息狀態(tài)PSC胞質(zhì)內(nèi)富含的A脂滴可以被油紅O染成紅色,，陽性表達(dá)Desmin,。激活狀態(tài)PSC陽性表達(dá)alpha-SMA。油紅O染色發(fā)現(xiàn),，原代分離的細(xì)胞培養(yǎng)6d,，胞漿中仍可見明顯的脂滴，傳代后,，橙紅色的脂滴顆粒顯著減少甚至消失,。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，細(xì)胞接種24h仍然表達(dá)Desmin,，48h后Desmin基本不再表達(dá),。培養(yǎng)48h后絕大多數(shù)細(xì)胞開始表達(dá)alpha-SMA，隨著培養(yǎng)時間的增長和傳代次數(shù)的增加,，細(xì)胞表達(dá)alpha-SMA，而不再表達(dá)Desmin,，說明細(xì)胞活化,。提示PSC接種24h后即啟動了激活過程，至培養(yǎng)第6d大多數(shù)細(xì)胞激活,，傳代后細(xì)胞處于高度激活狀態(tài),。原代胰腺星狀細(xì)胞可作為慢性胰腺炎新藥的細(xì)胞篩選模型，目前研究發(fā)現(xiàn)：胰腺受損時,，在各種刺激因子作用下使胰腺星狀細(xì)胞活化,，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、功能發(fā)生變化,，促使基質(zhì)增生,、膠原蛋白的大量生成及不規(guī)則沉積。

5.方法簡介：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔胰腺星狀細(xì)胞采用膠原酶消化法制備而來制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔胰腺星狀細(xì)胞經(jīng)α-SMA,、Desmin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體、細(xì)菌,、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-Rb048

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細(xì)胞形態(tài)成纖維細(xì)胞樣

傳代特性可傳3-5代

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

產(chǎn)品特點(diǎn):

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2、 可以處理各種細(xì)菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定。

6,、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低,。

7,、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等,。

8、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容,。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一,、凍存時的注意事項(xiàng)：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細(xì)胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否保有其*性質(zhì),，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存,，勿作多次解凍。使用的甘油也應(yīng)為試劑級等級,，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性,。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細(xì)胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后,。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6，依細(xì)胞種類而異,。腺癌類的細(xì)胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時,，亦應(yīng)作一個backup culture,，以防止冷凍失敗,。