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冷凍保存細胞之方法,？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存,。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下,， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存,。*-20 ℃不可超過1 小時,， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,，惟存活率稍微降低一些。

產(chǎn)品屬性：   

商品介紹：

 

實驗要點及說明：

1．本方法適用于貼壁細胞培養(yǎng),，而不適用于懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮細胞可使用滴片法,；

2．所使用的蓋玻片應該為優(yōu)質(zhì)玻璃,，并經(jīng)過鉻酸洗液處理,；

3．蓋玻片非常薄，易碎,，取放蓋玻片時動作要輕,；

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿,，但不宜過大,，以避免培養(yǎng)液的浪費和增加污染機率；

5．如果細胞貼壁生長能力較差,，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干,。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1,、無菌條件下,，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次,，將成1mm3左右大?。?/span>

2,、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶）,，混懸10s，置37℃條件下消化10min,，之后用滴管吹打制成單細胞懸液,，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置,；

3,、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s,，置37℃消化10 min后,，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次,，直至組織*被消化,；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液,，1200r/min 離心10min,，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸,，接種于25cm2培養(yǎng)瓶,，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

5,、差速貼壁1h后,，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng),；

二,、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時,，棄去培養(yǎng)基,，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min,，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min,；

2、PBS沖洗細胞2次,，每次10min,，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min,；

3,、PBS沖洗細胞2次，每次10min,，然后在室溫條件下,，用4% BSA封閉細胞30min,；

4,、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜,；

5,、PBS沖洗細胞3次，每次10min,，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗,， 37℃條件下放置1h；

6,、用PBS沖洗3次,，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照,。

 MAG / GMA / Siglec-4 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 VSTM1 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

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小鼠 APOA1 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 CCDC134 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 GBP1 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 VCL / Vinculin 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 IL-1R8 / IL1RAPL1 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

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