收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作,。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜,，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代,，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細(xì)胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。

產(chǎn)品名稱

名稱    小鼠前列腺上皮細(xì)胞

2.組織來源：前列腺

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡介：

小鼠前列腺上皮細(xì)胞分離自前列腺組織；前列腺（Prostate）是雄性*的性腺器官,；前列腺是不成對的實(shí)質(zhì)性器宮,，由腺組織和肌組織構(gòu)成,。前列腺如栗子，底朝上,，與膀胱相貼,，尖朝下，抵泌尿生殖膈,，前面貼恥骨聯(lián)合,，后面依直腸。前列腺腺體的中間有尿道穿過,，扼守著尿道上口,，所以，前列腺有問題時,，排尿首先受影響,。前列腺是機(jī)體非常少有的，具有內(nèi),、外雙重分泌功能的性分泌腺,。作為外分泌腺，前列腺每天分泌前列腺液,，是構(gòu)成精液主要成分,；作為內(nèi)分泌腺，前列腺分泌的激素稱為“前列腺素",。前列腺上皮細(xì)胞與前列腺的功能關(guān)系密切,，上皮細(xì)胞的損傷是前列腺炎的主要病癥，重度的前列腺炎患者的前列腺液內(nèi)可檢測到脫落的上皮細(xì)胞,，這是上皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志,。炎癥發(fā)生時，與炎癥相關(guān)的一些炎癥因子可能發(fā)生變化,。因此,，體外培養(yǎng)前列腺上皮細(xì)胞是研究前列腺炎及前列腺上皮肉瘤等疾病的前提和基礎(chǔ)。前列腺主要特征如下：①前列腺結(jié)構(gòu)和功能活動均受雄性激素的調(diào)控,；②基底細(xì)胞主要表達(dá)高分子量細(xì)胞角蛋白（CK-5,、CK-14），基底上皮細(xì)胞可分化成管腔上皮細(xì)胞,；③前列腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)為研究前列腺的許多重要特性以及化學(xué)和激素性致癌作用提供了機(jī)會,。

5.方法簡介：

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠前列腺上皮細(xì)胞采用先中性蛋白酶消化、后膠原酶-胰蛋白酶聯(lián)合消化并通過上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測：

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠前列腺上皮細(xì)胞經(jīng)PCK免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌,、酵母和真菌等。

7.培養(yǎng)信息：

包被條件鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-M064

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細(xì)胞形態(tài)上皮細(xì)胞樣

傳代特性可傳1-2代

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

產(chǎn)品特點(diǎn):

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備,。

2、 可以處理各種細(xì)菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體,。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4,、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低,。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等,。

8、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容,。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一、凍存時的注意事項(xiàng)：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細(xì)胞生長是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級等級,，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存,，勿作多次解凍,。使用的甘油也應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后,。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6,，依細(xì)胞種類而異,。腺癌類的細(xì)胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時,，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗,。