收到細(xì)胞后,，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜，放入37℃,，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過(guò)夜,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代,，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細(xì)胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。

產(chǎn)品名稱(chēng)

名稱(chēng)    小鼠視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞

2.組織來(lái)源：眼球

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡(jiǎn)介：

小鼠視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞分離自視神經(jīng)乳頭；視乳頭位于黃斑區(qū)鼻側(cè)附近,，境界清楚,，呈白色、圓盤(pán)狀,，因此也稱(chēng)為視盤(pán),。視網(wǎng)膜上視覺(jué)纖維在此匯集,，并于此穿出眼球向視中樞傳遞,。視乳頭中央有一小凹陷區(qū)，稱(chēng)為視杯或生理凹陷,。視乳頭是視神經(jīng)纖維聚合組成視神經(jīng)的起始端,，它沒(méi)有視細(xì)胞,，因而沒(méi)有視覺(jué)，在視野中是生理盲點(diǎn),。視乳頭是開(kāi)角型青光眼最早受損的部位,，星形膠質(zhì)細(xì)胞是視神經(jīng)乳頭處主要的膠質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型，可為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞無(wú)髓鞘的軸突提供結(jié)構(gòu)和生物支持,。青光眼視變是位不可逆性致肓眼病,。青光眼視變以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突喪失并伴有視乳頭處細(xì)胞外基質(zhì)重坦為主要特征,。導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞喪失的病理生理機(jī)制尚未*闡明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)調(diào)控神經(jīng)元微環(huán)境起多重作用,，越來(lái)越多的證據(jù)表明膠質(zhì)細(xì)胞町能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,、損傷、修復(fù)及再生起極為關(guān)鍵的作用,。視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體多扁平,，體積較大，形狀多呈不規(guī)則的多邊形,，突起較粗,，胞核為橢圓形，核仁清晰可見(jiàn),，核周有較密集物質(zhì),，胞質(zhì)稀疏，骨架結(jié)構(gòu)良好,，明顯不同于長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞形態(tài),。

5.方法簡(jiǎn)介：

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法、結(jié)合差速貼壁制備而來(lái),，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測(cè)：

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠視乳頭星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS,、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號(hào)CM-M188

換液頻率每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性貼壁

細(xì)胞形態(tài)梭形,、多角形

傳代特性可傳3代左右

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

產(chǎn)品特點(diǎn):

1、 使用方便:不需昂貴設(shè)備,。

2,、 可以處理各種細(xì)菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3,、 將蛋白提取的時(shí)間縮短至30分鐘-1小時(shí),。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6,、 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí),，背景干擾低。

7,、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑,；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等。

8,、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一,、凍存時(shí)的注意事項(xiàng)：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否保有其*性質(zhì),，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存,，勿作多次解凍。使用的甘油也應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性,。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細(xì)胞濃度不要太高，某些雜交瘤會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后,。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6,，依細(xì)胞種類(lèi)而異。腺癌類(lèi)的細(xì)胞解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類(lèi)細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,，以防止冷凍失敗,。