收到細胞后,，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng),。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當?shù)谋壤M行接種傳代,，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。

產(chǎn)品名稱

名稱    CIK細胞

由于該細胞同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細胞（自然殺傷細胞）樣T淋巴細胞,，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性,，和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點。該細胞對腫瘤細胞的識別能力很強,，能精確“點射"腫瘤細胞,，但不會傷及“無辜"的正常細胞。尤其對手術后或放化后患者,，能消除殘留微小的轉移病灶,，防止癌細胞擴散和復發(fā)，提高機體免疫力,，因此,，CIK細胞被認為是新一代的腫瘤過繼細胞免疫方案。

CIK細胞可以通過多機制抗腫瘤,、抗病毒：

1.CIK細胞能以不同的機制識別腫瘤細胞,，通過直接的細胞質顆粒穿透封閉的腫瘤細胞膜進行胞吐，釋放穿孔素,、顆粒酶,，實現(xiàn)對腫瘤細胞的裂解；

2.CIK細胞能分泌IFN-γ,、TNF-α,、IL-2、IL-6等多種炎性細胞因子,，對腫瘤也有直接抑制作用,；

3.CIK細胞可以通過配體-受體（Fas:FasL）介導的方式誘導腫瘤細胞凋亡，因此CIK尤其適用于FasL陽性腫瘤的,；

4.CIK細胞分泌的細胞因子能顯著刺激初始型T細胞增殖,，有效激活機體的免疫系統(tǒng)，使之趨于正常,，提高病人自身抗腫瘤的能力,。

目前，腫瘤的發(fā)生機制尚未形成普遍接受的理論,。研究者普遍認可腫瘤的發(fā)生,、發(fā)展與人體的免疫功能密切相關。即在正常情況下，腫瘤與機體的防御機能之間處于一種動態(tài)的平衡,，而一旦這種平衡被破壞,，就可能發(fā)生腫瘤。身體各組織細胞受到外界化學,、物理,、生物等因素刺激或自身細胞衰老變異等因素的影響，使得體內(nèi)某些細胞發(fā)生突變,，成為癌前細胞,；而機體免疫功能低下或者由于免疫異常，無法及時識別,、殺傷,、清除這些異常細胞，突變細胞在組織內(nèi)復制生長,，達到一定數(shù)量后破壞器官功能,，腫瘤即發(fā)生。腫瘤患者,，尤其是惡性腫瘤病人往往免疫功能,、特別是細胞免疫功能低下，因而疾病呈進展,、活動,、預后差。因此,，提高機體免疫力,，建立有效的免疫應答是腫瘤最有希望的途徑。CIK細胞即將大量殺傷性高,、功能強,、數(shù)量多的免疫活性細胞回輸患者體內(nèi)，直接發(fā)揮殺死腫瘤細胞的作用,，并通過調節(jié),、激活患者的免疫體系，調動,、提高患者自身的抗腫瘤能力,。

CIK細胞具有以下突出的特點：

1.增殖速度快，殺瘤活性高,。CIK細胞可以在體外大量擴增,，培養(yǎng)14天可以增殖200倍以上，其效應細胞CD3+CD56+的增殖可達1000倍以上,，抗腫瘤活性得以大大增強,。

2.殺瘤譜廣,。CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷是非MHC限制的，對多種腫瘤細胞均有殺滅作用,。

3.能抵抗腫瘤細胞引發(fā)的效應細胞Fas-FasL凋亡,。CIK細胞雖然在Fas被占據(jù)后會引起少量細胞凋亡,，但對其殺瘤細胞毒性沒有明顯影響,；反之，CIK細胞可以誘導FasL陽性腫瘤細胞的凋亡,。

4.對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感,。CIK細胞對放、化敏感的親本細胞和不敏感的轉化細胞均具有強大的殺傷活性,。

5.CIK細胞殺瘤活性不受CsA（環(huán)孢霉素A）和FK506（普樂可復）等免疫抑制劑的影響,。

6.對正常骨髓造血前體細胞毒性小，僅對紅系生成產(chǎn)生輕微的抑制,，這可能與CIK細胞自身分泌高水平的IFN-γ有關,。

7.CIK細胞具有識別腫瘤的機制，特異性強,，對正常的細胞無毒性作用,。

8.安全性好。CIK細胞是活化的患者自體細胞,，應用安全,，不會產(chǎn)生排斥等反應，患者副反應小,。

產(chǎn)品特點:

1,、 使用方便:不需昂貴設備。

2,、 可以處理各種細菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3,、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低,。

7,、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑,；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等,。

8,、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容,。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度,。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前,，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質,，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級,，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存，勿作多次解凍,。使用的甘油也應為試劑級等級,，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長期儲存后對細胞會有毒性,。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6,，依細胞種類而異,。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時,，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗,。