收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作,。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜，放入37℃,，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過夜,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代,，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細(xì)胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。

產(chǎn)品名稱

名稱    ACT-1 (甲狀腺癌細(xì)胞)

生長(zhǎng)特性貼壁細(xì)胞

生長(zhǎng)培養(yǎng)基RPMI-1640＋ 13.6 mg/L hypoxanthine 13.6 mg/L hypoxanthine(0.1 mM)＋ 0.176 mg/L aminopterin 0.176 mg/L aminopterin(0.4 μM)＋ 3.8 mg/L thymidine 3.8 mg/L thymidine(0.016 mM)＋ 20% FBS＋ 1% P/S

推薦換液頻率2~3次/周

凍存條件

凍存液：55% 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO

溫度：液氮

培養(yǎng)條件

氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

溫度：37℃

產(chǎn)品特點(diǎn):

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2,、 可以處理各種細(xì)菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3,、 將蛋白提取的時(shí)間縮短至30分鐘-1小時(shí),。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí),，背景干擾低,。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等,。

8、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容,。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一、凍存時(shí)的注意事項(xiàng)：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存,，勿作多次解凍,。使用的甘油也應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性,。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后,。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6，依細(xì)胞種類而異,。腺癌類的細(xì)胞解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí),，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,，以防止冷凍失敗。