產(chǎn)品名稱

名稱    大鼠直腸平滑肌細胞

2.組織來源：直腸組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

大鼠直腸平滑肌細胞分離自直腸組織；直腸為大腸的未段,，位于小骨盆內(nèi),。上端平第3骶椎處接續(xù)乙狀結(jié)腸，沿骶骨和尾骨的前面下行,，穿過盆膈,，下端以而終。直腸上端的大小似結(jié)腸,，其下端擴大成直腸壺腹,，是糞便排出前的暫存部位，最下端變細接,。直腸在盆腔內(nèi)的位置與骶椎腹面關(guān)系密切,，與骶椎有相同的曲度。直腸周圍多脂肪,、無縱帶,，位于膀胱和生殖器官的背側(cè)。直腸平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后,，可見細胞貼壁伸展,，細胞形態(tài)大小不一，呈梭形,、不規(guī)則形,、三角形或扇形，核卵圓形,、居中,；2周后細胞匯合，多數(shù)細胞伸展呈長梭形,，胞漿豐富,，有分枝狀突起，細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長,，高低起伏,；細胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀；密度高時,，則排列為旋渦狀或柵欄狀,。傳代后細胞生長較快，4-6天即可匯合,，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長特點,。直腸的動脈血供主要是來自腸系膜下動脈的直腸上動脈，來自髂內(nèi)動脈的直腸中動脈和來自髂內(nèi)動脈的直腸下動脈,。平滑肌收縮是胃腸蠕動中基本的運動方式,；腸炎時由于平滑肌特殊肌動蛋白的增加導(dǎo)致了平滑肌層的增厚。平滑肌肌動蛋白可能影響收縮力的產(chǎn)生,，這進一步證明了炎癥時的腸平滑肌細胞具有可塑性,。利用腸平滑肌細胞的培養(yǎng)，可以幫助了解收縮,、增殖和胃腸道結(jié)締組織對平滑肌細胞的反應(yīng),。

5.方法簡介：

實驗室分離的大鼠直腸平滑肌細胞采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測：

實驗室分離的大鼠直腸平滑肌細胞經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上，且不含有HIV-1,、HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌等。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-R042

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)成纖維細胞樣

傳代特性可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

產(chǎn)品特點:

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2,、 可以處理各種細菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3,、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低,。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等,。

8、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容,。

細胞處理：

1） 復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級等級,，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存,，勿作多次解凍,。使用的甘油也應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6,，依細胞種類而異,。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時,，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗,。

收到細胞后,，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 待細胞達到80%匯合時準(zhǔn)備進行傳代培養(yǎng)。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M行接種傳代,，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。