收到細胞后,，請按照以下方法進行操作,。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒,，拆下封口膜,，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng)。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察,，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻,，按1:2或1:3等適當的比例進行接種傳代，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察,。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

產品名稱

名稱    大鼠羊膜間質細胞

2.組織來源：胎盤組織

3.產品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

大鼠羊膜間質細胞分離自胎盤組織,；胎盤（placenta）是哺乳動物妊娠期間由胚胎的胚膜和母體子宮內膜聯(lián)合長成的母子間交換物質的過渡性器官，由羊膜,、葉狀絨毛膜和底蛻膜構成,。胎兒在子宮中發(fā)育，依靠胎盤從母體取得營養(yǎng),，而雙方保持相當的獨立性,。胎盤還產生多種維持妊娠的激素，是一個重要的內分泌器官,。有些爬行類和魚類也以胎生方式繁殖后代,，胚胎生長出一些輔助結構如卵黃囊、鰓絲等與母體組織緊密結合,，以達到母子間物質的交換,，這樣的結構稱假胎盤。羊膜是胎盤的最內層,，與眼結膜組織結構相似,，含有眼表上皮細胞，包括結膜細胞和角膜上皮細胞生長所需要的物質,，其光滑,，無血管、神經及淋巴,，具有一定的彈性,；在電鏡下，其分為五層：上皮層,、基底膜,、致密層、纖維母細胞層和海綿層,，羊膜基底膜和羊膜羊膜基質層含有大量不同的膠元,，主要為Ⅰ、Ⅲ,、Ⅳ,、Ⅴ,、Ⅶ型膠原和纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等成份,。羊膜細胞主要由羊膜上皮細胞和羊膜間充質細胞組成,，均具有多分化潛能，可轉化為神經元,，且還有合成,、釋放生物活性物質和神經營養(yǎng)因子的功能。

5.方法簡介：

實驗室分離的大鼠羊膜間質細胞采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質量檢測：

實驗室分離的大鼠羊膜間質細胞經Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

產品貨號CM-R226

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)成纖維細胞樣

傳代特性可傳3代左右

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

產品特點:

1,、 使用方便:不需昂貴設備。

2,、 可以處理各種細菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3,、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低,。

7,、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑,；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等,。

8,、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容,。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一,、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前,，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質，例如是否有雜細胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級,，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存,，勿作多次解凍,。使用的甘油也應為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內使用,，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6,，依細胞種類而異,。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時,，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗,。