收到細(xì)胞后,，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作,。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒,，拆下封口膜,，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過(guò)夜,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻,，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃,，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察,。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

產(chǎn)品名稱(chēng)

名稱(chēng)    兔脊髓神經(jīng)元細(xì)胞

2.組織來(lái)源：脊髓組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡(jiǎn)介：

兔脊髓神經(jīng)元細(xì)胞分離自脊髓組織,；脊髓是細(xì)細(xì)的管束狀的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，位于脊柱的椎管內(nèi)且被脊椎保護(hù),；是源自腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)延伸部分,。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞依靠復(fù)雜的聯(lián)系來(lái)處理傳遞信息,。脊髓的主要功能是傳送腦與外周之間的神經(jīng)信息。人和脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分,，在椎管里面,，上端連接延髓，兩旁發(fā)出成對(duì)的神經(jīng),，分布到四肢,、體壁和內(nèi)臟。脊髓的內(nèi)部有一個(gè)H形(蝴蝶型)灰質(zhì)區(qū),，主要由神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成,；在灰質(zhì)區(qū)周?chē)鸀榘踪|(zhì)區(qū)，主要由有髓神經(jīng)纖維組成；脊髓是許多簡(jiǎn)單反射的中樞,。脊髓兩旁發(fā)出許多成對(duì)的神經(jīng)(稱(chēng)為脊神經(jīng))分布到全身皮膚,、肌肉和內(nèi)臟器官,。脊髓是周?chē)窠?jīng)與腦之間的通路，也是許多簡(jiǎn)單反射活動(dòng)的低級(jí)中樞。按脊神經(jīng)的出入可把脊髓也分為相應(yīng)的31節(jié)，31對(duì)脊神經(jīng)就是由不同的脊椎發(fā)出的,。神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位是神經(jīng)元,，即神經(jīng)細(xì)胞，其大小和外觀在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中差異很大,。但都具有胞體和樹(shù)突,、軸突。胞體又叫核周體，內(nèi)含神經(jīng)絲,、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和一個(gè)有明顯核仁的核,。一些大神經(jīng)元突起的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可用Nissl染色顯示,，在光鏡下是灰藍(lán)色斑塊狀，稱(chēng)為尼氏小體。樹(shù)突和軸突是神經(jīng)元的突起,，能在神經(jīng)元之間傳遞電沖動(dòng)，突起的大小和形態(tài)各不相同，很難用常規(guī)的顯微鏡鑒別,。脊髓組織內(nèi)含有大量膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元含量少，分離純化難度大，且脊髓神經(jīng)元細(xì)胞是高度分化的終末細(xì)胞,，不能分裂增殖,，培養(yǎng)要求高,。剛接種的脊髓神經(jīng)元呈圓形，體積小,，透亮,，無(wú)突起。培養(yǎng)2-3d，可見(jiàn)胞體增大,，突起增多延長(zhǎng),；培養(yǎng)6-7d，細(xì)胞體大飽滿,，突起明顯增加延長(zhǎng)并交織成網(wǎng),，光暈明顯，立體感強(qiáng),。培養(yǎng)20d后,，死亡細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)空泡,，突起粗細(xì)不均,，甚至脫壁，發(fā)生細(xì)胞崩解,。

5.方法簡(jiǎn)介：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔脊髓神經(jīng)元細(xì)胞采用膠原酶&胰酶聯(lián)合消化法,、神經(jīng)元專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選結(jié)合化學(xué)試劑抑制法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測(cè)：

實(shí)驗(yàn)室分離的兔脊髓神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)β-Tubulin免疫熒光鑒定,，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

包被條件PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基含B-27 Supplement,、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號(hào)CM-Rb055

換液頻率每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性貼壁

細(xì)胞形態(tài)神經(jīng)元細(xì)胞樣

傳代特性屬于終末分化細(xì)胞,；屬于不增殖細(xì)胞群

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

產(chǎn)品特點(diǎn):

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2,、 可以處理各種細(xì)菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3,、 將蛋白提取的時(shí)間縮短至30分鐘-1小時(shí),。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí),，背景干擾低,。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等,。

8,、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容,。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對(duì)于貼壁細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái),，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一、凍存時(shí)的注意事項(xiàng)：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存,，勿作多次解凍。使用的甘油也應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用,，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細(xì)胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6,，依細(xì)胞種類(lèi)而異,。腺癌類(lèi)的細(xì)胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類(lèi)細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時(shí),，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗,。