收到細胞后,，請按照以下方法進行操作,。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜,，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng)。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察,，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻,，按1:2或1:3等適當?shù)谋壤M行接種傳代，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察,。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。

產(chǎn)品名稱

名稱    兔脊髓神經(jīng)元細胞

2.組織來源：脊髓組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

兔脊髓神經(jīng)元細胞分離自脊髓組織,；脊髓是細細的管束狀的神經(jīng)結構,，位于脊柱的椎管內(nèi)且被脊椎保護；是源自腦的中樞神經(jīng)系統(tǒng)延伸部分,。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞依靠復雜的聯(lián)系來處理傳遞信息,。脊髓的主要功能是傳送腦與外周之間的神經(jīng)信息,。人和脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分,，在椎管里面，上端連接延髓,，兩旁發(fā)出成對的神經(jīng),，分布到四肢、體壁和內(nèi)臟,。脊髓的內(nèi)部有一個H形(蝴蝶型)灰質區(qū),，主要由神經(jīng)細胞構成；在灰質區(qū)周圍為白質區(qū),，主要由有髓神經(jīng)纖維組成,；脊髓是許多簡單反射的中樞。脊髓兩旁發(fā)出許多成對的神經(jīng)(稱為脊神經(jīng))分布到全身皮膚,、肌肉和內(nèi)臟器官,。脊髓是周圍神經(jīng)與腦之間的通路，也是許多簡單反射活動的低級中樞,。按脊神經(jīng)的出入可把脊髓也分為相應的31節(jié),，31對脊神經(jīng)就是由不同的脊椎發(fā)出的。神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結構和功能單位是神經(jīng)元,，即神經(jīng)細胞,，其大小和外觀在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中差異很大,。但都具有胞體和樹突、軸突,。胞體又叫核周體,，內(nèi)含神經(jīng)絲、微管,、內(nèi)質網(wǎng),、游離核糖體和一個有明顯核仁的核。一些大神經(jīng)元突起的粗面內(nèi)質網(wǎng)可用Nissl染色顯示,，在光鏡下是灰藍色斑塊狀,，稱為尼氏小體。樹突和軸突是神經(jīng)元的突起,，能在神經(jīng)元之間傳遞電沖動,，突起的大小和形態(tài)各不相同，很難用常規(guī)的顯微鏡鑒別,。脊髓組織內(nèi)含有大量膠質細胞,，神經(jīng)元含量少，分離純化難度大,，且脊髓神經(jīng)元細胞是高度分化的終末細胞,，不能分裂增殖，培養(yǎng)要求高,。剛接種的脊髓神經(jīng)元呈圓形,，體積小，透亮,，無突起,。培養(yǎng)2-3d，可見胞體增大,，突起增多延長,；培養(yǎng)6-7d，細胞體大飽滿,，突起明顯增加延長并交織成網(wǎng),，光暈明顯，立體感強,。培養(yǎng)20d后,，死亡細胞明顯增加，細胞出現(xiàn)內(nèi)空泡,，突起粗細不均,，甚至脫壁，發(fā)生細胞崩解,。

5.方法簡介：

實驗室分離的兔脊髓神經(jīng)元細胞采用膠原酶&胰酶聯(lián)合消化法,、神經(jīng)元專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選結合化學試劑抑制法制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質量檢測：

實驗室分離的兔脊髓神經(jīng)元細胞經(jīng)β-Tubulin免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌,、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

包被條件PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基含B-27 Supplement、Penicillin,、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-Rb055

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)神經(jīng)元細胞樣

傳代特性屬于終末分化細胞,；屬于不增殖細胞群

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

產(chǎn)品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設備,。

2,、 可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體,。

3,、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4,、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性。

5,、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6,、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低,。

7,、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑,；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等。

8,、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度,。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一,、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質,，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級,，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存，勿作多次解凍,。使用的甘油也應為試劑級等級,，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性,。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后,。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6,，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture,，以防止冷凍失敗,。