收到細(xì)胞后,，請按照以下方法進(jìn)行操作,。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜,，放入37℃,，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細(xì)胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻,，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃,，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察,。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

產(chǎn)品名稱

名稱    膀胱平滑肌細(xì)胞

2.組織來源：膀胱組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡介：

人膀胱平滑肌細(xì)胞分離自膀胱組織,；膀胱是主要由平滑肌細(xì)胞組成的中空器官,，膀胱平滑肌的舒張和收縮使得膀胱分別儲存和排出尿液。膀胱平滑肌細(xì)胞表型的調(diào)控和可誘導(dǎo)一氧化氮合酶的表達(dá)與多種病理狀況有關(guān),，包括膀胱功能障礙,。研究表明，組織缺氧抑制膀胱平滑肌細(xì)胞的增殖,，膀胱平滑肌細(xì)胞的分化依賴于膀胱上皮細(xì)胞釋放的因子,。膀胱平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)的分泌表型可通過細(xì)胞所經(jīng)歷的機(jī)械變形頻率而改變。平滑肌是許多疾病中的共同路徑,，因此,，了解在疾病發(fā)生及持續(xù)過程中平滑肌怎樣變化，這是治療方法取得進(jìn)展的重要一步,。膀胱壁由三層組織組成,，由內(nèi)而外為黏膜層、肌層和外膜,。其中,，肌層主要由平滑肌構(gòu)成。膀胱平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)3天后,，可見細(xì)胞貼壁伸展,，細(xì)胞形態(tài)大小不一，呈梭形,、不規(guī)則形,、三角形或扇形,，核卵圓形,、居中；2周后細(xì)胞匯合,，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長梭形,，胞漿豐富，有分枝狀突起,，細(xì)胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長,，高低起伏；細(xì)胞密度低時，常交織成網(wǎng)狀,；密度高時,，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細(xì)胞生長較快,，4-6天即可匯合,，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長特點(diǎn)。體外培養(yǎng)膀胱平滑肌細(xì)胞不僅為組織工程膀胱,、尿道提供種植細(xì)胞的必要手段,，也是研究平滑肌瘤的基礎(chǔ)與前提。

5.方法簡介：

實(shí)驗(yàn)室分離的人膀胱平滑肌細(xì)胞采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來,，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測：

實(shí)驗(yàn)室分離的人膀胱平滑肌細(xì)胞經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細(xì)菌、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-H069

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細(xì)胞形態(tài)成纖維細(xì)胞樣

傳代特性可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

產(chǎn)品特點(diǎn):

1、 使用方便:不需昂貴設(shè)備,。

2,、 可以處理各種細(xì)菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體,。

3,、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4,、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性。

5,、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低,。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性,。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶,、天冬氨酸蛋白酶等,。

8、 本試劑盒中不有EDTA,，與金屬螯和層析等兼容,。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻,。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻,。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一,、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細(xì)胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否保有其*性質(zhì),，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存,，勿作多次解凍。使用的甘油也應(yīng)為試劑級等級,，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存,。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性,。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml,，細(xì)胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后,。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6,，依細(xì)胞種類而異。腺癌類的細(xì)胞解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml,。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture,，以防止冷凍失敗,。