名稱    兔骺軟骨細胞

2.組織來源：生長板組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

兔骺軟骨細胞分離自骨骺生長板；骨骺生長板位于長骨兩端骨骺和骨干之間的軟骨組織,，其中的骺軟骨細胞可分裂,、成熟、肥大，最終被骨組織所替換,，對于長骨生長具有重要作用。幼稚的骺軟骨細胞位于軟骨組織的表層,，單個分布,、體積較小、呈橢圓形,，長軸與軟骨表面平行,，越向深層的骺軟骨細胞體積之間增大呈圓形，細胞核圓形或卵圓形,，染色淺,，細胞質(zhì)弱嗜堿性，常見數(shù)量不一的脂滴,。成熟的骺軟骨細胞多2-8個成群分布于軟骨陷窩內(nèi),，這些骺軟骨細胞由同一個母細胞分裂增殖而成，稱為同源細胞群,。電鏡下,，骺軟骨細胞有突起和皺褶，細胞質(zhì)內(nèi)有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和發(fā)達的高爾基復合體及少量的線粒體,。在組織切片中,，骺軟骨細胞收縮為不規(guī)則形，在軟骨囊和細胞之間出現(xiàn)較大的腔隙,。體外培養(yǎng)的骺軟骨細胞對于研究其生理功能,、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具重要意義。

5.方法簡介：

實驗室分離的兔骺軟骨細胞采用膠原酶-中性蛋白酶聯(lián)合消化并軟骨細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶,。

6.質(zhì)量檢測：

實驗室分離的兔骺軟骨細胞經(jīng)Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光鑒定，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1,、HBV、HCV,、支原體,、細菌,、酵母和真菌等。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS,、生長添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-Rb016

換液頻率每3-4天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)梭形,、多角形

傳代特性可傳5代左右,；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%,；CO2,，5%

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品特點:

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2,、 可以處理各種細菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3,、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4、 采用溫和的中性裂解組分,，保持蛋白活性,。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑,，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6、 紫外檢測蛋白濃度時,，背景干擾低,。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解,，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑,；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等,。

8,、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容,。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度,。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前,，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級,，以5~10 ml 小體積分裝,，4 度避光保存，勿作多次解凍,。使用的甘油也應為試劑級等級,，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長期儲存后對細胞會有毒性,。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后,。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異,。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時,，亦應作一個backup culture,，以防止冷凍失敗,。

收到細胞后,，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒,，拆下封口膜，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜,，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng),。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右,；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化,；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當?shù)谋壤M行接種傳代,，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL,，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細胞*貼壁后,，培養(yǎng)觀察,。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。