收到細胞后,，請按照以下方法進行操作,。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶,，75%酒精消毒，拆下封口膜,，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩(wěn)定細胞狀態(tài),。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng),。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次,；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中,，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察,，待細胞回縮變圓后吸棄消化液,，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻,，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M行接種傳代,，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃,，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

4) 待細胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察,。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基,。

產(chǎn)品名稱

名稱    大鼠骨骼肌成纖維細胞

2.組織來源：骨骼肌組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

大鼠骨骼肌細胞分離自四肢肌肉組織,；骨骼肌又稱橫紋肌，肌肉中的一種,，約占全身重量的40%,。骨骼肌纖維為長柱形的多核細胞，肌膜的外面有基膜緊密貼附,。屬于橫紋肌,，橫紋肌還包括心肌與內(nèi)臟橫紋肌,，其中骨骼肌主要分布于四肢。每塊肌肉都是具有一定形態(tài),、結(jié)構(gòu)和功能的器官,，有豐富的血管、淋巴分布,，在軀體神經(jīng)支配下收縮或舒張,，進行隨意運動。肌肉可根據(jù)共形狀,、大小,、位置、起止點,、纖維方向和作用等命名,。依形態(tài)命名的如斜方肌、菱形肌,、三角肌,、梨狀肌等。骨骼肌細胞呈纖維狀,，不分支,，有明顯橫紋，核很多,，且都位于細胞膜下方,。肌細胞內(nèi)有許多沿細胞長軸平行排列的細絲狀肌原纖維。每一肌原纖維都有相間排列的明帶（Ⅰ帶）及暗帶（A帶）,。明帶染色較淺,，而暗帶染色較深。暗帶中間有一條較明亮的線稱H線,。H線的中部有一M線,。明帶中間，有一條較暗的線稱為Z線,。兩個Z線之間的區(qū)段,，叫做一個肌節(jié)。骨骼肌細胞也稱橫紋肌細胞,，細胞呈纖維狀,，不分支，有明顯橫紋,，核很多,，且都位于細胞膜下方，細胞多呈梭行,，具有一定的方向性,。

5.方法簡介：

實驗室分離的大鼠骨骼肌成纖維細胞采用胰蛋白酶-膠原酶混合酶消化后差速貼壁制備而來,，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質(zhì)量檢測：

實驗室分離的大鼠骨骼肌成纖維細胞經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定,，純度可達90%以上,，且不含有HIV-1、HBV,、HCV,、支原體、細菌,、酵母和真菌等,。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS、生長添加劑,、Penicillin,、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-R210

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)成纖維細胞樣

傳代特性可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

產(chǎn)品特點:

1,、 使用方便:不需昂貴設(shè)備,。

2、 可以處理各種細菌菌體,，包括新鮮菌液和冰凍菌體,。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時,。

4,、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性,。

5,、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定,。

6,、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低,。

7,、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化,。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑,；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性,，包括絲氨酸蛋白酶,、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等,。

8,、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容,。

細胞處理：

1） 復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度,。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于貼壁細胞,，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次,。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化,。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前,，應(yīng)觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高,，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細胞或者支原體等,。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級等級,，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存,，勿作多次解凍,。使用的甘油也應(yīng)為試劑級等級,，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長期儲存后對細胞會有毒性,。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高,，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后,。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異,。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml,。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO,，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時,，亦應(yīng)作一個backup culture,，以防止冷凍失敗。