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           人穿孔素/成孔蛋白(PF/PFP)ELISA檢測試劑盒說明書

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到

100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

人穿孔素/成孔蛋白(PF/PFP)ELISA檢測試劑盒操作步驟

1. 標(biāo)準品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準品孔10孔,，在di一、第二孔中分別加標(biāo)準品100μl,，然后在di一,、第二孔中加標(biāo)準品稀釋液50μl，混勻,；然后從di一孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準品稀釋液50μl,，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別取50μl分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準品稀釋液50μl,，混勻后從第七、第八孔中加到第五,、第六孔中,，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準品稀釋液50ul,，混勻,；混勻后從第五、第六孔中各分別取50μl加到第九、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標(biāo)準品稀釋液50μl,，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為180 ng/L，120 ng/L ,，60 ng/L,，30 ng/，15 ng/L）,。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、待測樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5,。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘。

人穿孔素/成孔蛋白(PF/PFP)ELISA檢測試劑盒注意事項

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果,。

3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差,。一次加樣時間好控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。

5. 底物請避光保存,。

6. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準.

7. 所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

8. 本試劑不同批號組分不得混用。

9.如需代測或者樣本暫時不測定,，可立即低溫凍存,，溫度越低越好，中間避免反復(fù)凍融,，-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月,。

10.人穿孔素/成孔蛋白(PF/PFP)ELISA檢測試劑盒試劑使用須知：

11.（1）請參照相關(guān)法規(guī)、文獻,、MSDS等信息,，理解并掌握好試劑的特性，再進行安全操作,。

12.（2）通常購買試劑時一定要想到一次性用完,。若估算不足有剩余的話，更加注意其他保管和管理,。

13.（3）萬一試劑操作者并非專業(yè)技術(shù)人員,。必須在專業(yè)人士的指導(dǎo)監(jiān)督下進行操作。對于使用后的廢棄物,，不要或者舊的試劑,，應(yīng)按照相關(guān)法律法規(guī)正當(dāng)處理。

14.（4）購買后,，請務(wù)必確認標(biāo)簽上的注意事項,；做好預(yù)防顛倒，摔壞的措施和管理體制；在使用前再次確認標(biāo)簽上的注意事項,，做好必要的安全對策,；對沒有標(biāo)明其危害特性、有害特性的,，也要慎重地進行操作,；必須帶好防護用具，小心翼翼進行操作,。