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                       鰓霉屬通用PCR檢測試劑盒說明書

特點優(yōu)勢：

    1.   特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過詳盡的生物信息學(xué)分析，經(jīng)過GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫的比對,，確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段,，可實現(xiàn)對細菌種屬及血清型的特異檢測，特異性均達到100%,。

    2.   重現(xiàn)性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過大量實驗菌株的驗證,，重現(xiàn)性為100%。

    3.   靈敏性：該系列產(chǎn)品可實現(xiàn)對檢測菌的高靈敏檢測,，當(dāng)樣品中細菌的濃度達到103cfu/ml時,，可實現(xiàn)對其的直接檢測，無需繁瑣的增菌過程,。

    4.   實用性：檢測范圍廣,，涵蓋了對人體危害較為嚴重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實現(xiàn)對臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測,，整個檢測過程為3-4個小時,。

    5.   優(yōu)勢1：序列資源豐富，除GenBank公布的序列外,，公司還進行了大量菌株的序列破譯,，從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。

    6.   優(yōu)勢2：該系列試劑盒均經(jīng)過大量的保守性及特異性實驗驗證,，憑借公司擁有的豐富的菌種資源,，每一種檢測試劑盒均經(jīng)過了20余種標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的保守性驗證及40余種近緣標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的特異性驗證，確保在使用過程中不會出現(xiàn)任何的假陽性及假陰性報告結(jié)果。

PCR使用方法：

一,、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容,。

2. 如果有 N 個樣品，則需要進行 N+2 個樣品提取,，多出的一個用作樣品制備陽性對照管,、另一個用作樣品制備陰性對照管,。如果用本試劑盒自帶的 DNA 釋放劑試用裝,。則按下面步驟操作： 

3. 配制溶液 A 工作液,。以配制 1mL 工作液（足夠 10 個樣品）為例：在一干凈塑料

管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水,，充分混合均勻即可,。溶液 A 工作液可室溫放置，但最好在一周內(nèi)用完,，不要長期放置,。一次檢測一個樣品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個樣品,。如果待測樣品數(shù)量為其他數(shù)字,，

配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。

4. 在標(biāo)記好的 N+2 個離心管中,，加入 1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大小，如奶酪）或5uL 液體樣品（如牛奶）待測樣品,。在樣品制備陽性對照中加入 5uL 陽性對照,，在樣品制備陰性對照中加入 5uL 水。

5. 在每個管中加入 100 uL 溶液 A 工作液,，確保固體樣品被溶液淹埋,，如果是液體樣品則震蕩混勻。

6. 95℃保溫 10 分鐘,。

7. 待冷卻到常溫后加入 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液,。每個樣品得到的 DNA釋放液足夠進行 50-100 次 PCR。

實驗規(guī)則：

1,、要保證移液槍的準(zhǔn)確性,，誤差不能超過2%?？捎盟碗娮犹炱竭M行確定,。但有專業(yè)人員進行矯正。

2,、要配備20ul,、50ul、100ul,、1000ul和排槍各一支,。吸取不同的液體后,，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時,。

3,、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫,，以使結(jié)果更穩(wěn)定,。

4、實驗時,，要使底物避光保存,。

5、用槍吸取液體時速度不能太快,，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確,。

6、吸取液體時,，要用量程和需要量接近的槍去吸,，減少誤差。

7,、將液體加到酶標(biāo)孔中時,，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸,，液滴會自然流下去,。

8、液體全部加完后,，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動30秒,，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動功能,。

9,、應(yīng)盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,。

10,、對結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進行確證。

PCR反應(yīng)流程常規(guī)程序

將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后,，在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘,，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環(huán),。在每一個循環(huán)中,，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復(fù)性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘,，使引物與模板充分退火,；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸,，合成DNA,，完成一個循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán)25～35次,，使擴增的DNA片段大量累積,。最后，在72℃保持3-7min,，使產(chǎn)物延伸完整,，4℃保存。

2．復(fù)性（退火）和延伸溫度

復(fù)性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guān)鍵因素,，通常在50-60℃之間,。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃,。如果復(fù)性的溫度很高,，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法PCR,。

3．反應(yīng)時間

變性步驟一般使用30秒鐘,，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板,，變性時間可適當(dāng)延長,。復(fù)性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定,，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間,。

4．循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān),，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級時,，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。

平臺效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象,。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低,，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用,，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用,，擴增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不ce底,。

5．PCR反應(yīng)液的配制

PCR反應(yīng)體系的配置方式有時也會影響反應(yīng)的正常進行,。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子,，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油,，防止水分蒸發(fā)。

對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時,，有時會擴增不出產(chǎn)物,。在遇到這個問題時，如果將反應(yīng)成分分開配制,，A管含模板,、引物和dNTP，以及調(diào)整體積的H2O,，B管含緩沖液,、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來,，可較好地克服這個問題,。

按照常規(guī)的方法配制反應(yīng)體系，有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題,。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題,。將dNTP、緩沖液,，Mg2+和primer先配制好,，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化,，再冷卻,，使蠟將溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分,。只有當(dāng)PCR反應(yīng)進入高溫階段后,，蠟層熔化，所有反應(yīng)成分才會混合在一起,。

實驗注意事項：

1）RT-PCR可以檢測組織,、細胞、血液,、細菌等很多材料,，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況,；

2）客戶盡可能提供實驗的背景信息,、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號,；

3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品,。

4）樣本保存于液氮或干冰,，也可以保存于Trizol液中。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，*通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法,。實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類,，探針類是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴增的增加,。運用該技術(shù)可以對DNA,、RNA樣品進行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析,、基因表達差異分析,、基因分型。

主要技術(shù)：引物設(shè)計,、RNA提取,、cDNA合成、qPCR,。

試劑使用須知：

（1）請參照相關(guān)法規(guī),、文獻、MSDS等信息,，理解并掌握好試劑的特性,，再進行安全操作。產(chǎn)品僅用于科研

（2）通常購買試劑時一定要想到一次性用完,。若估算不足有剩余的話,，更加注意其他保管和管理。

（3）萬一試劑操作者并非專業(yè)技術(shù)人員,。必須在專業(yè)人士的指導(dǎo)監(jiān)督下進行操作,。對于使用后的廢棄物，不要或者舊的試劑,，應(yīng)按照相關(guān)法律法規(guī)正當(dāng)處理,。

（4）購買后，請務(wù)必確認標(biāo)簽上的注意事項,；做好預(yù)防顛倒,，摔壞的措施和管理體制,；在使用前再次確認標(biāo)簽上的注意事項,，做好必要的安全對策；對沒有標(biāo)明其危害特性,、有害特性的,，也要慎重地進行操作；必須帶好防護用具，小心翼翼進行操作,。