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黃頭桿狀病毒PCR檢測試劑盒使用說明書
閱讀：81 發(fā)布時間：2020-12-31| 提 供 商 | 上海谷研實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 15.7KB |
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黃頭桿狀病毒PCR檢測試劑盒說明書
技術(shù)原理：
DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下,，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。
在聚合酶鏈式反應(yīng)實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，并設(shè)計引物做啟動子,，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）
發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床,。
黃頭桿狀病毒PCR檢測試劑盒特點優(yōu)勢：
1.用特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過詳盡的生物信息學(xué)分析，經(jīng)過GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫的比對,，確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段,，可實現(xiàn)對細菌種屬及血清型的特異檢測，特異性均達到,。
2. 重現(xiàn)性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過大量實驗菌株的驗證,，重現(xiàn)性為,。
3. 靈敏性：該系列產(chǎn)品可實現(xiàn)對檢測菌的高靈敏檢測,，當(dāng)樣品中細菌的濃度達到103cfu/ml時，可實現(xiàn)對其的直接檢測,，無需繁瑣的增菌過程,。
4. 實用性：檢測范圍廣,，涵蓋了對人體危害較為嚴重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實現(xiàn)對臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測,，整個檢測過程為3-4個小時,。
5. 優(yōu)勢1：序列資源豐富，除GenBank公布的序列外,，公司還進行了大量菌株的序列破譯,，從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。
6. 優(yōu)勢2：該系列試劑盒均經(jīng)過大量的保守性及特異性實驗驗證,，憑借公司擁有的豐富的菌種資源,，每一種檢測試劑盒均經(jīng)過了20余種標(biāo)準菌株和臨床菌株的保守性驗證及40余種近緣標(biāo)準菌株和臨床菌株的特異性驗證，確保在使用過程中不會出現(xiàn)任何的假陽性及假陰性報告結(jié)果,。
反應(yīng)五要素：
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶、dNTP,、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列,， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增,。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp,，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴增長至10kb的片段,。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補,，否則會形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個堿基,，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點,， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,，且可增加引物之間形成二聚體的機會,。
黃頭桿狀病毒PCR檢測試劑盒樣本采集、存放及運輸：
1,、樣本采集：各類型樣本按照常規(guī)方法采集,；
2、存放：樣本在2~8℃條件下保存應(yīng)不超過72h,，-70℃以下可長期保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（多凍融3次）；
3,、運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸,。
需要自備的器材：
1．用儀器：分析天平、離心機,、熒光 PCR 擴增儀,、組織研磨器、-20 ℃冰箱,、可調(diào)移液器（2 µL,、20
µL、200 µL,、1000 µL）,。
2．耗材：熒光 PCR 反應(yīng)管、眼科剪,、眼科鑷,、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水
處理的滅菌離心管,、吸頭（10 µL,、200 µL、1000 µL）,、滅菌雙蒸水,。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2,、 標(biāo)準品（凍干品）： 2瓶,，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘,，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L,，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）,，分別配制成200 U/L，100 U/L,，50 U/L,，25 U/L，12.5 U/L,，6.25 U/L,，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L,。如配制100 U/L標(biāo)準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
3,、 樣品稀釋液：1×20ml。
4,、 檢測稀釋液A：1×10ml,。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml,。
操作流程：
1. 整個檢測過程應(yīng)嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū),、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服,、儀器 ,、耗材應(yīng)獨立使用，不能混用,；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭,；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作,；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置,。
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,，且完成實驗后立即上機檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。
3. 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰,、陽性對照,。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心。
5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準備區(qū),，并單獨存放,。
6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標(biāo)記,。產(chǎn)品僅供科研使用
7. 儀器 擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用,。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,，淬滅基因選擇None。
9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進行無害化處理后方可丟棄,。
黃頭桿狀病毒PCR檢測試劑盒注意事項：
1,、使用本試劑前請仔細閱讀本說明書全文。
2 ,、操作時應(yīng)盡量少說話,，因口腔中也含有支原體，可能引起樣品污染,，而造成假陽性,；整個檢測過程中，反應(yīng)體系的配制,、樣本處理及加樣,、PCR擴增應(yīng)分區(qū)域進行，以避免交叉污染,。
3 ,、實驗時，試劑盒組分中的試劑使用前應(yīng)充分融化并混勻（混勻時禁止激烈振蕩,，只需要進行上下倒置多次進行混勻）,。
4、 反應(yīng)管中加好所有的試劑后,，應(yīng)盡快上PCR儀進行擴增,，以免形成過多的二聚體。
5,、細胞培養(yǎng)物中含有青霉素和鏈霉素等抗生物素不會影響本品的檢測結(jié)果,。如果用戶需要進一步提高檢測。